مقدمه 
مالاریا از مهم‌ترین بیماری‌های انگلی است که توسط تک‌یاخته‌ای از جنس پلاسمودیوم ایجاد می‌شود. این بیماری به وسیله گونه‌های به‌خصوصی از پشه‌های آنوفل ماده منتقل می‌شود. 
در سال ۲۰۱۸‌،۲۲۸ میلیون مورد از بیماری مالاریا در دنیا گزارش شد که در مقایسه با ۲۳۱ میلیون مورد بیماری در سال ۲۰۱۷ سیر نزولی دارد. موارد مرگ‌و‌میر هم در سال ۲۰۱۸، ۴۰۵ هزار مورد بوده است که نسبت به سال ۲۰۱۷ و گزارش۴۱۶ هزار مورد سیر نزولی داشته است. 
این بیماری علاوه بر اینکه طی حملات خود نیروی بیمار را به شدت تحلیل می‌برد و باعث کاهش شدید فعالیت هایبیمار در دوران بیماری می‌شود، موجب تضعیف بهداشت و رفاه عمومی در خانواده‌ها شده، حیات افراد، مخصوصاً با ضعف، سیستم ایمنیرا به مخاطره می‌اندازد و باعث فرسودگی بیش از حد جامعه و منابع انسانی کشورها می‌شود. 
به دلیل سهولت مسافرت و تبادل جمعیتی با مناطق مالاریاخیز، امکان مشاهده بیمار مبتلا به مالاریا و بازگشت بیماری در تمام مناطق جغرافیایی کشور حتی در مناطق پاک وجود دارد و خطر بروز همه‌گیری‌های گسترده در مناطق دارای پتانسیل انتقال همواره مطرح است [2 ،1]. 
به دلیل برنامه حذف مالاریا در جهان و استفاده از درمان ترکیبی آرتمیزین و داروهای دیگر، مرگ‌و‌میر مالاریا در جهان پایین آمده است، ولی متأسفانه در نقاط مختلف جهان فراوانی سوش‌های پلاسمودیوم فالسیپاروم، که به داروهای استاندارد مانند کلروکین مقاوم هستند، افزایش یافته است. 
در سال‌های اخیر یکی از علل اصلی مرگ‌و‌میر مالاریا افزایش مقاومت دارویی گزارش شده؛ بنابراین دانشمندان در پی جست‌وجوی دارویی جدید جهت مهار کردن این بیماری هستند [2 ،1].
با پیشرفت علم پزشکی و علوم وابسته، در سال‌های اخیر مطالعات فراوانی در مورد خواص شیمیایی انواع توکسین‌ها انجام گرفته است. در ایران انواع مارهای سمی و نیمه سمی، مانند کفچه مار، مار کبری، مارهای دریایی، افعی شاخدار، گرزه مار، افعی دماوندی، افعی البرز و مار جعفری زیست می‌کنند. 
مار کبرای ایران (Naja Naja Oxiana) از مارهای خانواده الاپیده بوده که در مناطق وسیعی از شمال شرقی ایران به فراوانی یافت می‌شود. این مار از مارهای بسیار خطرنـاک محـسوب شـده و زهـر آن حاوی فاکتورهای توکسیک عصب‌گرا با وزن مولکولی نسبتاً پایین است. 
امروزه از بزاق یا به عبارتی همان زهرمارها می‌توان انواع داروها، سرم و واکسن را تهیه کرد. در این تحقیق برای تعیین میزان بار انگلی از روش مولکولی Real-time PCR دقیق با حساسیت و اختصاصیت بالا استفاده کردیم که تأیید‌کننده نهایی روش‌های دیگر تعیین بار انگلی است [6-3]. 
در مطالعات پیشین، محققین اثرات ضد پلاسمودیوم برگئی عصاره الکلی زردچوبه و گیاه تاجریزی بلوچی در موش را نشان دادند [8 ،7]. 
مطالعات سال‌های گذشته نشان داده که ائوزین B به عنوان داروی جدید ضد انگل مالاریا در شرایط برون‌تنی و درون‌تنی می‌تواند مطرح باشد. محققین به بررسی اثر ضد سرطانی زهر مار ناجا ناجا اکسیانا ایرانی با القای آپوپتوز روی سلول‌های سرطانی پرداختند [10 ،9]. 
در سال‌های گذشته محققین با افزایش موارد مقاومت داروییبهانگل پلاسمودیوم فالسیپاروم در برابر داروهای رایج در درمانبه تحقیق در مورد خواص انواع زهر مارها پرداختند. نتایج نشان داد که زهر مار Bothrop asper و زهر مار زنگی آمریکای جنوبی دارای خواص نفوذ سلولی و ضد قارچی و ضد انگلی هستند [12 ،11]. 
هدف ما از این تحقیق، بررسی اثر ضد پلاسمودیوم فالسیپاروم (در مرحله رینگ) فراکشن فعال جدا‌شده از سم مار کبرای ایرانی با روش Real-time PCR با تعیین بار انگلی بود.

مواد و روش‌ها
تعیین دُز موثر فراکشن فعال مرحله دوم یا (IC50) با روش Real-time PCR
برای انجام این مطالعه تجربی ابتدا زهر لیوفیلیزه را از در انستیتو پاستورآزمایشگاه ونوم و فرآورده‌های دارویی تهیه کردیم. پس از جداسازی فراکشن‌ها با روش ژل فیلتراسیون، اندازه‌گیری غلظت پروتئین ونوم و فراکشن‌های تخلیص‌شده انجام شد. فراکشن مؤثر با افزایش غلظت دارای اثر کشندگی بیشتر بود؛ بنابراین بقیه مراحل تخلیص روی این فراکشن فعال انجام شد و به عنوان فراکشن کاندید انتخاب شد.
در مرحله بعد، کشت انگل پلاسمودیوم‌ فالسیپاروم را انجام دادیم. پس از جداسازی فراکشن‌های زهر با روش ژل فیلتراسیون و سپس تغلیظ فراکشن‌ها به روش لیوفیلیزاسیون، تعیین فراکشن فعال از میان فراکشن‌های تخلیص‌شده که بیشترین اثر کشندگی انگل را داشت، مشخص شد. از فراکشن فعال انتخاب شده، غلظت‌های 1/100، 1/1000، 1/10000، 1/100000، 1/1000000 و 1/10000000 تهیه شد. 
سپس تعیین دُز مؤثر فراکشن فعال یا (IC50) با روش مولکولی دقیق انجام شد. روش مولکولی qPCR جهت تأیید نهایی IC50 که در تحقیقات قبلی ما با روش‌های معمولی رنگ‌آمیزی گسترش خونی و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) پلاسمودیوم فالسیپاروم که هیچ‌کدام حساسیت و اختصاصیت روش‌های مولکولی را ندارند، انجام شده بود [۱۳]. 

استخراج DNA
برای بررسی سطح بیان ژن‌های 18s rRNA پلاسمودیوم فالسیپارم همه مراحل استخراج زیر هود لامینار انجام شد و قبل از شروع کار زیر هود با وایتکس و الکل 70 درصد تمیز شد.
وسایل کار برای استخراج شامل سمپلرها، سرسمپلرها و میکروتیوب که زیر هود قرار داشتند و به مدت بیست دقیقه تحت UV قرار گرفت. تمامی سرسمپلرها و میکروتیوب‌ها RNase-DNase Free بودند و قبل از شروع کار در دو دوره زمانی 45 دقیقه اتوکلاو شده بودند.
ابتدا پانصد میکرولیتر خون در فالکون پانزده ریخته با آب دو بار تقطیر به حجم هفت میلی‌لیتر رساندیم. سپس ده دقیقه تکان داده شد. در این مرحله بهتر است درِ فالکون‌ها با پارا فیلم بسته شود. به مدت دوازده دقیقه با دور rpm3000 در سانتریفیوز یخچال‌دار، سانتریفیوژ شد. 
سپس مایع رویی را خالی کردیم تا رسوب دست‌نخورده باقی بماند. آب مقطر اضافه کردیم و مراحل قبل تکرار شد تا مایع رویی سفید شد. سپس 250 تا 300 میکرولیتر بافر لیز اضافه کردیم. 
در مرحله بعد پنجاه میکرولیتر پروتئیناز K اضافه کردیم. در مرحله بعد داخل انکوباتور در دمای 37 درجه سلسیوس over night قرار دادیم. پس از اضافه کردن هم حجم بافر لیز فنل، داخل سانتریفیوز یخچال‌دار با دور چهارده هزار به مدت سیزده دقیقه سانتریفیوژ کردیم، بعد از سانتریفیوژ خارج کرده، مایع رویی را وارد میکروتیوب جدید کرده و هم حجم محلول رویی کلروفرم اضافه کردیم. 
سپس داخل سانتریفیوز یخچال‌دار با دور دوازده هزار به مدت یازده دقیقه سانتریفیوژ کردیم.مایع رویی را در ویال جدید وارد کردیم و سپس هم حجم محلول جدا‌شده ایزوپرویانل (حدود پانصد میکرو لیتر) به لوله‌ها اضافه شد. بعد از پنج تا ده ثانیه تکان دادن لوله‌ها، آنها را ده دقیقه در دمای اتاق ساکن قرار دادیم [15 ،14].
شست‌وشوی DNA
برای خارج کردن کامل کلروفرم، رسوب DNA با اتانول 75 درصد شست‌وشو داده شد. به این منظور به رسوب RNA مقدار یک میلی‌لیتر اتانول 75 درجه سلسیوس اضافه و به آرامی مخلوط شد. بعد میکروتیوب را به مدت پنج دقیقه در ˚˚C4 و g 7500 سانتریفوژ کردیم. در مرحله بعد مایع رویی توسط سمپلر دور ریخته شد.

خشک کردن رسوب DNA
برای خشک شدن نسبی رسوب ده دقیقه درِ میکروتیوب باز گذاشته شد. در تمام این مراحل سعی شد مقادیر به طور دقیق و صحیح رعایت شوند.
ژن 18s rRNA در پلاسمودیوم دارای کپی نامبر بالایی است. قدم اول در انجام Real-‌time PCR تعیین هدف است. هدف ما اندازه‌گیری کپی نامبر ژن 18s rRNA بود که مؤید پارازیتمی است. در واقع این تست تأییدی برای تست شمارش انگل به روش رنگ آمیزی گیمسا و تعیین آنزیم لاکتات دهیدروژناز است.
با استفاده از روش Quantification Absolute و با استفاده از یک منحنی استاندارد تعداد دقیق نسخه‌های 18s rRNA کلون در puc57 در نمونه‌ها مشخص شد.
با توجه به مطالعه تیلر و همکاران [15] از پرایمر معرفی‌شده در مقاله کمک گرفتیم و پس از بلاست کردن آن، این نتیجه حاصل شد که این پرایمر با گونه‌های فالسیپاروم، ناولزی، ویواکس، اووال و برگئی 100 درصد تطابق ژنتیکی داشت. نوع سنجش مورد نظر با دستگاهReal-time PCR از نوع ABI Step One و استفاده از روش SYBR Green بود.
مواد لازم برای انجامReal-time PCR
Injection Water و سمپلــر، پنس، میکرو تیوب پنجاه میکرولیتــری Cool Box‌، کیت Primer Design Master SYBR‌، دستگاهABI Step One، درپوش آنها. 

روش انجام آزمایش Real-time PCR 
ابتدا در دو ویال 0/2 سی‌سی مواد زیر به آرامی و روی یخ با سمپلر مخلوط شد. در این مطالعه برای همه پرایمرهای استفاده شده در واکنش Real-time PCR ،Stock‌های 10 درصد از Stock اولیه µl100 تهیه شد و سپس حجم‌های لازم از پرایمرها وارد 15 µL واکنش شد. همچنین در این مطالعه در هر µL از ‍DNA به میزان 15ng نمونه وجود داشت. مواد لازم جهت انجام Real-time PCR در جدول شماره ۱ نشان داده شده‌اند.



پس از یک spin پنج ثانیه‌ای درنهایت استریپ‌ها را به دستگاه Real-time PCR انتقال دادیم تا تحت برنامه داده‌شده به دستگاه عمل کند. 
 در این روش از نمونه DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد. غلظت DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر 260 نانومتر تعیین شد و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل شد. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است. 
در مورد ژن 18s rRNA توالی آن ‌را یافته، سپس برای سنتز به شرکت تکاپوزیست ارسال شد (جدول شماره ۲). ژن سنتز شد. از نمونه‌های استاندارد به صورت سریالی رقت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار داده شد.

 


با استفاده از (Threshold Cycle) که دستگاه برای هر رقت به ما می‌دهد، یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT بود، نمودار به‌دست‌آمده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار، غلظت یا تعداد کپی آن نیز به دست می‌آید. 234 bp طول توالی ژن است. 
AACACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATGaGTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCTAATTAGCGGTAAATACACTATATTCTTAAGTGAAATTAGAATATAGATAAATTGTGCTAATTTTGATTAAAATATTAGAATG
پس از اینکه از حالت لیوفیلیزه با اضافه کردن µl 100 آب مقطر تزریقی به حالت مایع درآمد، غلظت آن ‌را با نانودراپ سنجیدیم. ده نانو‌گرم در میلی‌لیترغلظت داشت.

فرمول تبدیل غلظت به تعداد نسخه‌های ژن: 


غلظت ده نانوگرم X = amount of amplicon (ng) 
 234 جفت باز N = length of dsDNA amplicon
660 g/mole = average mass of 1 bp dsDNA
در هر نانوگرم صد هزار نسخه ژن وجود داشت، ابتدا رقت سریالی از غلظت ده نانوگرم از ژن 18s rRNA را تهیه شد و سپس نمونه‌ها به صورت دوتایی آماده شدند. پس از یک اسپین پنج ثانیه‌ای در‌نهایت استریپ‌ها را به دستگاه Real-time PCR انتقال دادیم تا تحت برنامه داده‌‌شده به دستگاه عمل کند. 
شرایط سیکل دمایی Real-time PCR برای ژنهدف به قرار زیر بود 
یک مرحله ˚˚C95 برای چهارده دقیقه جهت فعال‌سازی آغازی آنزیم پلیمراز، در ادامه چهل سیکل که شامل ˚˚C95 برای پانزده ثانیه و ˚˚C60 برای شصت ثانیه بود، برای مرحله anealing/extention صورت گرفت و درنهایت برای رسم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) ˚˚C95 برای پانزده ثانیه‌، ˚˚C70 برای شصت ثانیه و ˚˚C 95 برای پانزده ثانیه انجام شد [17 ،16].

یافته‌ها 
تست تعیین بار انگلی روی فراکشن‌های جدا‌شده در مرحله رینگ در پلیت کشت انجام شد. از سم رقت‌های مختلف استفاده شد و میزان پارازیتمی با روش مولکولی دقیق Real-time PCR جهت تأیید روش‌های رنگ‌آمیزی گیمسا، لاکتات دهیدروژنازدر هر‌کدام از چاهک‌ها انجام شد تا مؤثرترین فراکشن فعال روی انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم تعیین شود.
تعیین دُز مؤثر فراکشن فعال مرحله دوم یا (IC50) با روش Real-time PCR
در تصویر‌های زیر می‌توان منحنی تکثیر و ذوب مربوط به ژن 18s rRNA را مشاهده کرد. برای آنالیز نتایج مربوط به بررسی کمّی بیان ژن، اطلاعات به‌دست‌آمده از بیان ژن 18s rRNA با نتایج حاصل از منحنی استاندارد ژن 18s rRNA سنتز و کلون‌شده و در PUC57 نـرمـال‌سازی شد. 
با کمک نمودارهای تکثیر میزان CT(Threshold Cycle) نمونه‌ها مشخص شد و به کمک منحنی ذوب (Melt curve) وجود باند‌های غیر‌اختصاصی و پرایمر دایمر وجود محصول غیراختصاصی مشخص شد. نمودار‌ها نشان‌دهنده اختصاصی بودن شرایط انجام Real-time PCR برای این ژن‌ است. 
منحنی استاندارد ژن 18srRNA سنتز‌شده و کلون‌شده در PUC57 در روش برون‌تنی در تصویر شماره 1 مشخص شده است.



منحنیژن 18srRNA سنتز‌شده و کلون‌شده در PUC57 و نمونه‌های استخراج‌شده از انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم در محیط کشت در مجاورت فراکشن فعال جهت تست IC50 در روش برون‌تنی در تصویر شماره 2 نشان داده شده است.



در تصویر شماره 3 منحنی ذوبژن 18srRNA سنتز‌شده و کلون‌شده در PUC57 جهت تست IC50 در روش برون‌تنی قابل مشاهده است.




تصویر شماره 4 منحنی تکثیرژن ژن 18srRNA سنتز‌شده و کلون‌شده در PUC57 جهت تست IC50 در روش برون‌تنی را مشخص می کند. در تصویر شماره 5 IC50فراکشن فعال حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی با روش Real-time PCR تعیین شده است.






بحث 
انگل پلاسمودیوم، عامل مولد مالاریا تأثیر بسیار گسترده‌ای در سلامت جوامع انسانی در سطح جهان دارد. به واسطه سرعت پیشرفت و توزیع جغرافیایی وسیع مقاومت انگل در برابر داروهای رایج ضدمالاریا، تهیه داروهای مختلف جدید علیه این بیماری یک ضرورت قطعی است. ظهور مقاومت دارویی به معنای افزایش خطر عوارض جانبی و یا مخارج بیشتر در استفاده از داروهای جدید است [۲]. 
انگل پلاسمودیوم در مرحله رینگ دارای فعالیت متابولیک بالایی است. به این دلیل از مرحله رینگ انگل استفاده کردیم که در ادامه تحقیقات به بررسی پروفایل متابولیت‌های انگل در حضور غلظت معینی از فراکشن فعال سم مار کبری، به منظور شناسایی محل‌های تأثیر‌گذاری این دارو روی متابولیسم انگل و تعیین متابولیت مؤثر در شکستن مقاومت دارویی مالاریابپردازیم.
امروزه ثابت شده که زهر مار به عنوان یک منبع بیولوژیکی فعال، مخلوطی از پروتئین‌ها (آنزیمی و غیرآنزیمی) و ترکیبات غیرپروتئینی از قبیل فلزات، چربی‌ها، نوکلئوتید‌ها، کربوهیدرات‌ها و آمین‌ها است. 
مهم‌ترین آنزیم‌ها شامل فسفولیپاز A2‌، آمینو اسید اکسیداز، فسفو دی استراز، استیل کولین استراز، آرژینین استر هیدرولاز و آنزیم‌های پروتئولیتیک هستند. یکی از انواع تقسیم‌بندی عمومی زهر مارها، تقسیم‌بندی بر اساس تأثیرات آنها است که به نوروتوکسین، هموتوکسین، میوتوکسین و کاردیوتوکسین دسته‌بندی می‌شوند [6 ،5]. 
جیلانوم و همکاران نشان دادند که کاهش فسفولیپید در محیط کشت پلاسمودیوم فالسیپاروم با استفاده از آلبومکس دو که لیپوپروتئین کمتری دارد، فعالیت آنتی‌پلاسمودیومی فسفولیپاز A2 (استخراج‌شده از زهر مار زنگی) را کاهش می‌دهد. نقش آنزیماتیک فسفولیپاز A2 در کنترل رشد انگل مالاریا در مطالعه جیلانوم و همکاران به وضوح نشان داده شده است [۱۸]. 
کاستیلو و همکاران به بررسی فعالیت آنزیم فسفولیپاز A2 و فسفولیپاز هومولوگ‌شده حاصل از زهر مار Bothrop asper با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی پرداختند و نشان دادند که فسفولیپاز A2 و هومولوگ آن، اثر آنتی‌پلاسمودیومال دارند [11].
 مالوف و همکاران نشان دادند که کروتامین پلی‌پپتیدی از زهر مار زنگی آمریکای جنوبی با خواص نفوذ سلولی و خواص ضدقارچی و ضدانگلی می‌تواند از توسعه پلاسمودیومفالسیپاروم در دُز IC50=1.87 میکرومولار جلوگیری کند [12].  از آنجا که شناسایی دقیق و سریع عوامل عفونی از مطالبات مهم جامعه پزشکی است، روش‌های مولکولی در موارد زیادی جایگزین مناسبی با روش‌های معمولی هستند. در میان روش‌های مولکولی، Real-time PCR(qPCR) گستردگی روزافزونی در شناسایی عوامل عفونت‌زا یافته است، این روش که بر مبنای شناسایی و تکثیر ژنوم میکروارگانیسم‌ها عمل می‌کند، دارای حساسیت بسیار بالایی در تشخیص است، به طوری که قادر است تعداد بسیار اندک پاتوژن‌ها را که با روش‌های دیگر قابل شناسایی نیستند، تشخیص دهد.
از دیگر مزایای آن می‌توان به توانایی تشخیص عوامل عفونی در مراحل ابتدایی، حساسیت، ویژگی، دقت و سرعت در تعیین جنس، گونه و تحت گونه میکروارگانیسم‌ها همچنین تعیین مقاومت دارویی اشاره کرد.
منگولد و همکاران برای افتراق گونه‌های پلاسمودیوم در نمونه358 بیمار در سنگاپور از روش Real-time PCR استفاده کردند.در این روش از رنگ سایبرگرین و از ژن 18s rRNA استفاده کردند و این روش 0/01 -0/02 پارازیتمی حساسیت داشت. 82 بیمار که از نظر میکروسکوپی منفی گزارش شدند، با روش Real-time PCR از نظر پلاسمودیوم مثبت بودند [14].
تیلر و همکاران با استفاده از روش Real-time PCR ،‌DNA انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم را از خون کامل استخراج کرده و با استفاده از رنگ سایبرگرین و استفاده از ژن 18s rRNA به تعیین پارازیتمی پرداختند و این روش استخراج DNA انگل پلاسمودیوم فالسیپاروم از خون کامل را روشی سریع، دقیق و به‌صرفه در شناسایی بیماران مشکوک پیشنهاد کردند [17 ،15].
وجود یک آزمون اختصاصی و حساس برای تشخیص این انگل در تعیین IC50 بسیارضروری به نظر می‌رسد. در این پژوهش از روش PCR Real-time برای شناسایی انگل استفاده شد که روشی حساس و اختصاصی است. ژن 18s rRNA که برای طراحی پرایمر استفاده شده، دارای تعداد کپی زیادی در ژنوم انگل است. 
در مطالعات پیشین از پرایمرهایی بر اساس ژن 18S rRNA برای تشخیص پلاسمودیوم فالسیپاروم و پلاسمودیوم ویواکس استفاده شده که مشابه پرایمرهایی هستند که در این تحقیق به کار رفته است. حساسیت این روش نسبت به روش متداول و معمولی مانند میکروسکوپی بیشتر است و نتایج این تحقیق با نتایج محققین قبلیدر این زمینه هم‌خوانی دارد [20 ،19]. 
ابراهیم‌زاده و همکاران [۱۶] و ذاکری و همکاران [۲۰] از ژن 18s rRNA برای سنتز پرایمر استفاده کردند و Nested PCR را مناسب جهت تشخیص پلاسمودیوم از خون محیطی پیشنهاد کردند. 
علاوه بر تأمین بودجه جهت خرید کیت و زمان رسیدن آنها،رشد سخت انگل و آلودگی محیط کشت آن، تنظیمReal-time PCR و عدم دسترسی آسان به مواد اولیه و آنزیم را می‌توان از مهم‌ترین محدودیت‌ها و مشکلات تحقیق نام برد.
نتیجه‌گیری 
تعیین بار انگلی با روش مولکولی qPCR تأیید‌کننده قطعی روش‌های تعیین‌کننده بار انگلی به روش‌های رنگ‌آمیزی و سنجش لاکتات دهیدروژناز انگل بود که در مطالعه قبلی انجام شده بود. 
نتایج به‌دست‌آمده نشان داد اثر ضد پلاسمودیومی فراکشن فعال سم مار کاملاً مشهود است. این نتایج امیدوارکننده،انگیزه را برای ادامه تحقیقات پیشرفته در این زمینه ایجاد می‌کند؛ بنابراین با توجه به نتایج به‌دست‌آمده، رسیدن به ایجاد داروهای آنتی‌مالاریای مؤثر جدید پس از تحقیقات سیستماتیک در این زمینه خیلی دور از ذهن نخواهد بود. 

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی ایران این مقاله را تأیید کرده است (کد اخلاق: IR.IUMS.REC1395.9223651202).

حامی مالی
این تحقیق از پروژه تحقیقاتی (شماره: IR.IUMS.REC1395.9223651202)دانشگاه علوم پزشکی ایران بودجه دریافت کرده است.

مشارکت نویسندگان
 تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله از دانشگاه علوم پزشکی ایران و انستیتو پاستور ایران برای تأمین اعتبارات لازم و همکاری در انجام آزمایشات تخصصی پروژه تشکر و قدردانی می‌کنند.

1. Chirebvu E, Chimbari MJ, Ngwenya BN. Assessment of risk factors associated with malaria transmission in tubu village, northern botswana.Malaria Research and Treatment. 2014; 2014:403069. [DOI:10.1155/2014/403069] [PMID] [PMCID]
2. Sant’Ana CD, Ticli FK, Oliveira LL, Giglio JR, Rechia CG, Fuly AL, et al. BjussuSP-I: A new thrombin-like enzyme isolated from Bothrops jararacussu snake venom. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 2008; 151(3):443-54. [DOI:10.1016/j.cbpa.2007.02.036] [PMID]
3. Utkin YN. Animal venom studies: Current benefits and future developments. World Journal of Biological Chemistry. 2015; 6(2):28-33. [DOI:10.4331/wjbc.v6.i2.28] [PMID] [PMCID]
4. Liu CC, Yang H, Zhang LL, Zhang Q, Chen B, Wang Y. Biotoxins for cancer therapy. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2014; 15(12):4753-8. [DOI:10.7314/APJCP.2014.15.12.4753] [PMID]
5. Dhananjaya BL, Sivashankari PR. Snake venom derived molecules in tumor angiogenesis and its application in cancer therapy; An overview. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2015; 15(7):649-57. [DOI:10.2174/1568026615666150225113402] [PMID]
6. Malleswari M, Josthna P, Doss PJ. Orally Administered Venom of Naja Naja Alters Protein Metabolic Profiles in the Liver of Albino Rats. International Journal Of Life Sciences Biotechnology And Pharma Research. 2015; 4(1):10-6. https://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.676.7515&rep=rep1&type=pdf
7. Heydarian P, Nateghpour M, Mazhari N, Motevalli Haghi A, Farivar L, Souri E, et al. Evaluation of Effectiveness of Ethanolic Extract of Curcuma longa, discretely and in Combination with Chloroquine against Chloroquine-Sensitive Strain of Plasmodium berghei. Herbal Medicines Journal. 2018; 3(4):133-8. http://eprints.lums.ac.ir/id/eprint/1961
8. Garedaghi Y, Khaki A. Evaluation of the effectiveness of ethanolic extract of solanum surattense against plasmodium berghei in comparison with chloroquine in sourian mice using in vivo tests. Crescent Journal of Medical and Biological Sciences. 2014; 1(3):76-9. http://www.cjmb.org/text.php?id=113
9. Massimine KM, McIntosh MT, Doan LT, Atreya CE, Gromer S, Sirawaraporn W, et al. Eosin B as a novel antimalarial agent for drug-resistant Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2006; 50(9):3132-41. [DOI:10.1128/AAC.00621-06] [PMID] [PMCID]
10. Ebrahim K, Vatanpour H, Zare A, Shirazi FH, Nakhjavani M. Anticancer activity a of Caspian Cobra (Naja naja oxiana) snake venom in human cancer cell lines via induction of apoptosis. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2016; 15(Suppl):101-12. [PMID] [PMCID]
11. Castillo JC, Vargas LJ, Segura C, Gutiérrez JM, Pérez JC. In vitro antiplasmodial activity of phospholipases A2 and a phospholipase homologue isolated from the venom of the snake Bothrops asper. Toxins. 2012; 4(12):1500-16. [DOI:10.3390/toxins4121500] [PMID] [PMCID]
12. El Chamy Maluf S, Dal Mas C, Oliveira EB, Melo PM, Carmona AK, Gazarini ML, et al. Inhibition of malaria parasite Plasmodium falciparum development by crotamine, a cell penetrating peptide from the snake venom. Peptides. 2016; 78:11-6. [DOI:10.1016/j.peptides.2016.01.013] [PMID]
13. Hajialiani F, Elmi T, Mohamadi M, Sadeghi S, Shahbazzadeh D, Ghaffarifar F, et al, Analysis of the active fraction of Iranian Naja naja oxiana snake venom on the metabolite profiles of the malaria parasite by 1HNMR in vitro. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2020; 23(4):534-43. [DOI:10.1128/JCM.43.5.2435-2440.2005]
14. Mangold KA, Manson RU, Koay ES, Stephens L, Regner M, Thomson RB Jr, et al. Real-time PCR for detection and identification of Plasmodium spp. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43(5):2435-40.[DOI:10.1128/JCM.43.5.2435-2440.2005] [PMID] [PMCID]
15. Taylor BJ, Martin KA, Arango E, Agudelo OM, Maestre A, Yanow SK. Real-time PCR detection of Plasmodium directly from whole blood and filter paper samples. Malaria Journal. 2011; 10:244.[DOI:10.1186/1475-2875-10-244] [PMID] [PMCID]
16. Ebrahimzadeh A, Fouladi B, Fazaeli A. High rate of detection of mixed infections of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum in South-East of Iran, using nested PCR. Parasitology International. 2007; 56(1):61-4. [DOI:10.1016/j.parint.2006.12.001] [PMID]
17. Taylor SM, Juliano JJ, Trottman PA, Griffin JB, Landis SH, Kitsa P, et al. High-throughput pooling and Real-time PCR-based strategy for malaria detection. Journal of Clinical Microbiology. 2010; 48(2):512-9. [DOI:10.1128/JCM.01800-09] [PMID] [PMCID]
18. Guillaume C, Deregnaucourt C, Clavey V, Schrével J. Anti-Plasmodium properties of group IA, IB, IIA and III secreted phospholipases A2 are serum-dependent. Toxicon. 2004; 43(3):311-8. [DOI:10.1016/j.toxicon.2004.01.006] [PMID]
19. Parvazi S, Sadeghi S, Azadi M, Mohammadi M, Arjmand M, Vahabi F, et al. The effect of aqueous extract of cinnamon on the metabolome of Plasmodium falciparum using 1HNMR spectroscopy. Journal of Tropical Medicine. 2016; 2016:3174841.[DOI:10.1155/2016/3174841] [PMID] [PMCID]
20. Zakeri S, Mamaghani S, Mehrizi A, Shahsavari Z, Raeisi A, Arshi S, et al. Molecular evidence of mixed P. vivax and P. falciparum infections in northern Islamic Republic of Iran. Eastern Mediterranean health journal. 2004; 10(3):336-42. https://apps.who.int/iris/handle/10665/119418