مقدمه
سال‌های زیادی است که بیماری سرطان افراد متعددی را تحت‌تأثیر قرار داده و به‌عنوان عامل اصلی مرگ‌و‌میر در سراسر جهان شناخته شده است. این مشکل هم در کشورهای توسعه‌یافته و هم در کشورهای کمتر توسعه‌یافته جزء مسائل جدی درمانی به شمار می‌رود [1]. سرطان پانکراس شایع‌ترین سرطان قرن و یکی از کشنده‌ترین سرطان‌های مربوط به سیستم گوارش در جهان است، به‌طوری‌که میزان مرگ‌و‌میر ناشی از آن بسیار بالاست و به‌علت علائم ناخوشایند مانند متاستاز و همچنین مقاومت به شیمی‌درمانی، موجب کسب رتبه چهارم در مرگ‌و‌میر شده است [2]. 
آمارها حاکی از این است که احتمالاً این میزان مرگ‌و‌میر افزایش پیدا می‌کند و حتی امکان دارد تا سال 2030 به دومین عامل مرگ‌و‌میر تبدیل شود [3]. نتایج مطالعات بر‌اساس آخرین داده‌های ملی ثبت سرطان در ایران مبتنی بر کل جمعیت کشور (با پوشش 100 در‌صدی)، افزایش 43 درصدی موارد جدید بروز سرطان‌ها از سال 96 تا سال 1404 در مقایسه با دهه پیش از آن (1395) را پیش‌بینی کرده است. همچنین براساس همین مطالعه ایران در منطقه «خطر متوسط» نقشه جهانی سرطان قرار دارد.
متداول‌ترین روش‌های درمان این بیماری جراحی، شیمی‌درمانی، رادیوتراپی، ایمنی‌تراپی و هورمون‌تراپی است، اما بیشترین روش‌های درمانی که برای سرطان پانکراس استفاده می‌شود، عمدتاً شامل جراحی همراه با شیمی‌درمانی است [4]. داروهای شیمی‌درمانی رایج درمان سرطان پانکراس رژیم مبتنی بر فلوروپیریمیدین، 5-‌فلورویوراسیل، جمسیتابین‌ و ناب پاکلیتاکسل است [5]. 
اگرچه شیمی‌درمانی در بیشتر رژیم‌های ضد‌سرطانی یک روال معمول برای درمان محسوب می‌شود، اما در‌حال‌حاضر با توانایی سلول‌های سرطانی در ایجاد مقاومت در برابر داروهای شیمی‌درمانی معمولی، یکی از چالش‌برانگیزترین مشکلات در درمان سرطان است. همچنین با‌وجود پیشرفت قابل‌توجه در تولید داروهای ضد‌سرطان، برخی عوارض جانبی مانند ریزش مو، آسیب به کبد، کلیه، مغز استخوان و مقاومت ذاتی یا اکتسابی به این داروها هنوز حل‌نشده باقی مانده‌اند [6]. 
امروزه تحقیقات روی فرآورده‌های طبیعی به‌دلیل افزایش تقاضا در‌زمینه طب مکمل که اثرات جانبی کم و ایمنی بالایی دارند، افزایش یافته است [7]. در‌این‌بین، درمان بیماری‌ها و کاهش علائم آن‌ها با بهره‌گیری از عصاره‌های گیاهی به سبب عوارض ناخواسته و سمیت کمتر در مقایسه با ترکیبات سنتزی بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است و حتی برخی از ترکیبات به دست‌آمده از گیاهان به‌علت دارا بودن ﻭیژگی‌های منحصر‌به‌فرد در ساختمان شیمیایی خود به‌عنوان الگو یا پیش‌ساز در جهت ساخت ترکیبات مؤثره با اثردهی بیشتر و سمیت کمتر مورد استفاده قرار گرفته‌اند [8].
هارمین (C13H12ON2) یک آلکالوئید از دسته بتا کربولین است که به‌طور طبیعی در بسیاری از گیاهان یافت می‌شود، اما عمده‌ترین منبع آن گیاه اسپند معمولی با نام علمی Peganum Harmala است که به طیف گسترده‌ای از خواص دارویی هارمین شامل خواص ضد سرطان، ضدالتهاب، آنتی‌اکسیدان، ضد افسردگی و ضدمیکروبی توجه شده است [9]. با توجه به نکات گفته‌شده در‌خصوص سرطان و درمان‌های شیمیایی و همچنین اثرات ماندگار شیمی‌درمانی به‌نظر می‌رسد استفاده از ترکیبات طبیعی گیاهی در کنار داروی شیمیایی باعث اثرات درمانی مؤثرتر و مفیدتری باشد. ازجمله ژن‌های آپوپتوتیک مورد‌مطالعه در این تحقیق ژن Bax، ژن P53 و ژن‌های کاسپاز 3 و 9 است. 
ژن P53 از مهم‌ترین مهارکننده‌های چرخه تکثیر سلولی است که عموماً آن را با نام محافظ ژنوم معرفی می‌کنند. روش عمل این مولکول بدین صورت است که با ایجاد وقفه در مرحله G2 باعث مهار چرخه سلولی شده و بدین صورت با القای آپوپتوز از ایجاد تومور جلوگیری می‌کند. تخریب DNA عامل اصلی فعالیت این مولکول است. از‌جمله پروتئین‌های کلیدی در روند آپوپتوز، پروتئین Bax است که فعالیت آن به عوامل موجود در مسیر داخلی آپوپتوز بستگی دارد که همراه با پروتئین ضد‌آپوپتوزی Bcl2 جزء ژن‌های مهم دخیل در مسیر میتوکندریایی آپوپتوز به‌حساب می‌آید.
کاسپازها انواعی از پروتئازهای سیستئین آسپارتات مربوط به مسیر آپوپتوز هستند که در تنظیم و اجرای آپوپتوز نقش مهمی ایفا می‌کنند. نام کاسپازها از عملکرد آن‌ها (Cysten Spartate Proteinase) گرفته شده است. این خانواده در پستانداران 14 عضو دارد که 11 عضو آن‌ها آنزیم‌های انسانی هستند. کاسپازها بر‌اساس عملکردشان به 2 نوع آغازگر شامل کاسپازهای 8، 9 و 10 و اجرایی شامل کاسپازهای 3، 6 و 7 دسته‌بندی می‌شوند. مسیر بیرونی شامل کاسپازهای 8 و 10 و مسیر داخلی شامل کاسپاز 9 هستند که هر 2 مسیر هم‌گرا بوده و از کاسپازهای اجرایی استفاده می‌کنند که به‌طور آبشاری فعال شده و موجب انهدام سلول‌ها می‌شود. در بسیاری از مطالعات دیده شده که تغییر در عملکرد کاسپازها احتمالاً می‌تو‌اند با ایجاد سرطان در ارتباط باشد. هدف از این مطالعه، بررسی اثرات هم‌افزایی داروی فلورویوراسیل و هارمین در القای آپوپتوز رده سلولی سرطان پانکراس (AsPC-1) و بیان ژن‌های آپوپتوتیک (Bax ،‌P53 و کاسپاز 3 و 9) است.
مواد و روش‌ها
کشت سلولی و تعیین سمیت سلولی
رده سلولی AsPC-1 از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران تهیه و در محیط کشت (‌RPMI1640 Bioidea ,‌Iran) با 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی‌بیوتیک در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد دی‌اکسیدکربن کشت داده شد. با رسیدن تراکم سلول‌ها به 80 درصد، سمیت سلولی غلظت‌های مختلف هارمین (2، 5، 7، 10، 15، 20، 25، 30، 40 و 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و فلورویوراسیل (5، 10، 15، 20، 25، 30، 35، 40، 45 و 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و ترکیب توأم آن‌ها (غلظت‌های 5، 10 و 15 میکروگرم بر میلی‌لیتر از داروی فلورویوراسیل همراه با غلظت‌های مؤثر هارمین، از‌جمله 15، 20 و 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر) روی سلول‌های سرطان پانکراس انسانی رده AsPC-1 با روش (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) MTT ارزیابی شد. 
از تمام غلظت‌ها به‌عنوان گروه‌های مورد‌مطالعه همراه با یک گروه به‌عنوان کنترل استفاده شد. ابتدا تست‌های MTT با چند بار تکرار انجام شد، نتایج آنالیز شد و سپس بهترین غلظت‌ها از هارمین و فلورویوراسیل به‌عنوان غلظت‌های مؤثر در آزمایش هم‌افزایی استفاده شد [19]. برای این منظور سلول‌ها با تراکم 104× 2 سلول در پلیت 96 خانه (با تکرار n برابر 4) کشت داده شدند. 24 ساعت پس از کشت، سلول‌ها با غلظت‌های مختلف هارمین و فلورویوراسیل و ترکیب توأم آن‌ها 24 ساعت آزمایش شدند. پس از این مدت، سمیت سلولی با روش MTT ارزیابی شد. نتایج توسط آزمون آماری آنووا با سطح معناداری P<0/05 بررسی و آنالیز شد. 
رنگ‌آمیزی DAPI
با استفاده از روش‌ رنگ‌آمیزی (4,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) DAPI می‌توان به تأیید تأثیر سیتوتوکسیک و آنتی‌پرولیفراتیو هارمین، فلورویوراسیل و ترکیب توأم آن‌ها روی سلول‌های ASPC-1 پرداخت. ابتدا 105‌×‌2 سلول درون هر چاهک پلیت 6 خانه به مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور کشت شدند. سپس سلول‌ها در مجاورت برای هارمین (30 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، فلورویوراسیل (‌35 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و توأم (10 میکروگرم فلورویوراسیل همراه با 20 میکروگرم هارمین) قرار گرفتند.
دُزهای استفاده‌شده در آزمایش DAPI با استفاده از نتایج تست MTT و میزان IC50 محاسبه‌شده برای سلول‌ها به دست آمد. بعد از 24 ساعت با متانول به مدت 10 دقیقه فیکس شدند و سپس با رنگ DAPI به مدت 10 دقیقه رنگ‌آمیزی شده و سپس هسته‌های آپوپتوزی با استفاده از میکروسکوپ فلوروسنت ارزیابی و عکس‌برداری شد [20].
آزمون فلوسایتومتری
ارزیابی آپوپتوز توسط کیت تشخیصی انکسین پروپودیوم یداید انجام شد. بدین‌ترتیب که سلول‌ها پس از 24 ساعت کشت درون پلیت تحت آزمایش با هارمین (30 میکروگرم بر میلی‌لیتر)، فلورویوراسیل ( 35 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و توأم (10 میکروگرم فلوراسیل همراه با 20 میکروگرم هارمین)، به مدت 24 ساعت قرار گرفتند. سپس محیط رویی گروه کنترل و 3 گروه آزمایش به اپندورف منتقل و در دور 4500‌‌rpm‌  و به مدت 8 دقیقه سانتریفیوژ شدند. با خارج کردن محیط رویی به هر نمونه 500 میکرولیتر Binding Buffer 1X اضافه کرده و سپس 5 میکرولیتر Annexin V-FITC و 5 میکرولیتر پروپودیوم یداید تهیه‌شده از شرکت Abcam ایالات متحده به هر نمونه اضافه شد. سپس در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه در تاریکی انکوبه شده و برای رسم نمودارهای آن به‌وسیله دستگاه فلوسایتومتری اقدام شد [10]. 
بیان ژن‌های آپوپتوزی
پس از شمارش سلولی میزان 106×1 سلول‌های AsPC-1 سرطان پانکراس انسانی 24 ساعت کشت داده شدند و سپس با هارمین و فلورویوراسیل و به‌صورت توأم با غلظت‌های مشخص 24 ساعت آزمایش شدند. سپس RNA بر‌اساس پروتکل کیت استخراج RNA شرکت Parstous ایران استخراج و تعیین غلظـت کمی RNA به روش نانودراپ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Epoch, BioTek, Winooski, VT, United States) انجام شد. 
سپس RNA اسـتخراج‌شده به cDNA تبدیل شد که بر‌اساس پروتکل کیت سنتز cDNA (Parstous, Iran) و با دسـتگاه ترموسایکلر، شرکت سازنده Bioer چین انجام شد. برای سنتز cDNA مقدار لازم از RNA آنزیم و بافر به حجم نهایی 20 میکرولیتر در میکروتیوب تهیه و ابتدا 10 دقیقه در دمای 25 درجه و سپس 60 دقیقه در دمای 47 درجه سانتی‌گراد در دستگاه ترموسایکلر، انکوبه شد. جهت توقف واکنش از دمای 85 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه استفاده شد. پس از انجام واکنش میکروتیوب حاوی cDNA به ظرف یخ در دمای 4 درجه منتقل شد. همچنین برای هریک از ژن‌های اختصاصی مورد‌مطالعه و ژن کنترل داخلی یک جفت پرایمر، طراحی شد (جدول شماره 1). 


پرایمرهای اختصاصی توسط نرم‌افزار الیگو 7 طراحی و سپس میزان CG دمای پرایمر و اتصال اختصاصی آن‌ها در ســایت NCBI بررسی و BLAST شید و در‌نهایت، بیان ژن‌های آپوپتوزی  ،Bax کاسپاز 3، کاسپاز 9 و p53 با استفاده از رنگ فلورسنت سایبرگرین (Parstous, Iran) با روش Real Time-PCR در سلول‌های AsPC-1 سرطان پانکراس انسانی توسط دسـتگاه Bio Rad (Bio Rad CFX, United States) بررسی شد. برنامه دمایی مورد استفاده شامل دناتوراسیون اولیه دمای 94 درجه به مدت 15 دقیقه، سپس 40 سیکل شامل آنلینگ در دمای 56 درجه به مدت 30 ثانیه و سنتز در دمای 72 درجه به مدت 30 ثانیه انجام شد. در آنالیز بیان ژن‌ها از نرم‌افزار CFX و فرمول (اختلاف میانگین cycle of threshold ΔΔct) استفاده شد [15].
یافته‌ها
نتایج بررسی سمیت با آزمون MTT
نتایج نشان داد بین غلظت‌های مورد‌مطالعه هارمین، غلظت 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر و برای فلورویوراسیل، غلظت 35 میکروگرم بر میلی‌لیتر و در حالت توأم غلظت 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر دارو همراه با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر از هارمین باعث مرگ نیمی از سلول‌ها (IC50) شده است (تصویر شماره 1).

در مقابل سلول‌های سرطانی، از سلول‌های نرمال (L929) برای اطمینان از اثر‌بخشی آزمایش‌ها استفاده شد. نتایج برای رعایت اختصار گزارش نشده است.
نتایج بررسی مورفولوژی سلولی
نتایج حاصل از مورفولوژی نشان داد 24 ساعت پس از آزمایش در غلظت‌ 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر هارمین تقریباً نیمی از سلول‌ها از حالت چند‌وجهی خارج شده و کروی می‌شوند. همچنین در غلظت‌ 35 میکروگرم بر میلی‌لیتر فلورویوراسیل نیز سلول‌ها گرد شده و از حالت نرمال خارج می‌شوند که این حالت گرد شدن در گروه هم‌افزایی با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر از هارمین و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از داروی فلورویوراسیل نیز مشاهده شد.
نتایج بررسی هسته سلولی با رنگ DAPI 
همان‌طور‌که در تصویر شماره 2 نشان داده می‌شود نتایج حاصل از رنگ فلورسنت DAPI نشان داد در سلول‌های AsPC-1 پس از آزمایش و بعد از گذشت 24 ساعت هسته‌ها قطعه قطعه شدند و شکل هسته‌ها از حالت نرمال خارج و چروکیده می‌شود که بیانگر وقوع آپوپتوز در این سلول‌هاست.

این در حالی است که در گروه کنترل هسته‌ها سالم و یکپارچه هستند.
تعیین نوع و میزان مرگ سلولی القا‌شده حاصل از آزمون Annexin V-FITC 
همان‌طور‌که در تصویر شماره 3 نشان داده می‌شود، نتایج آزمون انکسین 5 -پروپیدیوم یداید نشان داد در‌حالی‌که در گروه کنترل 92 درصد سلول‌‌ها زنده بودند، در گروه هارمین با غلظت 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر حدود 40 درصد زنده و 52 درصد دچار آپوپتوز شده‌اند.

در سلول‌های تحت آزمایش با غلظت 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر در حدود 35 درصد از سلول‌ها دچار آپوپتوز شده بودند و سلول‌های تحت آزمایش با هم‌افزایی هارمین و فلورویوراسیل حدود 60 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوز شدند و تنها حدود 15 درصد زنده‌اند. با رسم نمودارها درصد سلول‌های زنده در سمت چپ پایین و درصد سلول‌هایی که در مراحل اولیه آپوپتوز قرار دارند در سمت راست پایین و درصد سلول‌ها در مرحله آپوپتوز ثانویه در سمت راست بالا و درصد سلول‌هایی که به سمت نکروز رفته‌اند در سمت چپ بالا مشخص می‌شود [10].
نتایج بررسی تغییرات بیان ژن
تصویرهای شماره 4 و 5 نتایج بیان ژن‌های مورد‌مطالعه تحت تأثیر هارمین، فلورویوراسیل و ترکیب توأم را در مقایسه با گروه کنترل نشان می‌دهد.

تصویر شماره 4 بیان ژن‌ها را به تفکیک و تصویر شماره 6 هر 4 ژن را در یک تصویر نشان می‌دهد.

در هر 4 ژن مورد‌مطالعه اثر هم‌افزایی هارمین و فلورویوراسیل افزایش معنادار بیان ژن را نشان می‌دهد، سطح معناداری 0/05<P درنظر گرفته شده است. نتایج مربوط به بیان ژن‌های کاسپاز 3 و 9 نشان می‌دهد اگرچه در گروه آزمایش با هارمین و آزمایش با فلورویوراسیل نیز افزایش بیان دیده می‌شود، اما در گروه هم‌افزایی هارمین فلورویوراسیل این افزایش برای کاسپاز 3 برابر با 0/03=P و معنادار است و برای کاسپاز 9 نیز مقدار 0/029=P را نشان می‌دهد. در ژن‌های BAX و P53 افزایش بیان معنادار (0/01=P) فقط در گروه هم‌افزا دیده می‌شود و آزمایش با هارمین و فلورویوراسیل به‌تنهایی نتوانسته تغییرات معنادار بیان ژن را باعث شود. این نتایج نشان می‌دهد ترکیب و کاربرد هم‌زمان داروی فلورویوراسیل و هارمین به‌طور معناداری (0/05<P) باعث افزایش بیان ژن‌های مورد‌نظر شده است. 
تصویر شماره 7 نتایج کیفی نمونه‌هایی از RNA‌های استخراج‌شده روی ژل آگارز و همچنین جدول شماره 2 نتایج غلظت نمونه‌هایی از RNA استخراج‌شده به روش نانودراپ را نشان می‌دهد. 

بحث
در این پژوهش تجربی برای بررسی اثرات سیتوتوکسیک هارمین، فلورویوراسیل و ترکیب هم‌افزایی این 2 ماده روی تکثیر سلول‌های سرطانی پانکراس رده AsPC-1 از آزمون MTT و برای بررسی آپوپتوز در سلول‌های تحت آزمایش از آنالیز فلوسایتومتری و رنگ‌آمیزی DAPI استفاده شد و در‌نهایت، تغییرات در میزان بیان ژن‌های آپوپتوزی کاسپاز 3، کاسپاز 9، BAX و P53 بررسی شد. 
نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد آزمایش سلول‌ها هم توسط هارمین و هم فلورویوراسیل و همچنین در حالت هم‌افزایی می‌تواند به‌صورت وابسته به دُز موجب کاهش زیست‌پذیری و افزایش سیتوتوکسیک شود. در تمام موارد از سلول‌های نرمال L929 در کنار سلول‌های سرطانی تست انجام شد که نتایج آن گزارش نشده است. در مطالعه گائو و همکاران مشخص شد غلظت‌‌های مختلف هارمین می‌تواند اثر سیتوتوکسیک بر سلول‌های سرطانی تخمدان (SKOV-3) داشته باشد و به روش وابسته به غلظت جلوی رشد این سلول‌ها را بگیرد [11]. 
در مطالعه‌ای که در سال 2021 میلکزارک انجام داد، روی اثر هم‌افزایی داروی شیمی‌درمانی فلورویوراسیل و یک آنالوگ سولفورافان (حاصل از کلم بروکلی) روی چندین رده سلولی سرطان پروستات (LNCaP و PC-3) و کولون (HT-29 و Caco-2) انجام شد، مشخص شد زمانی که داروی شیمی‌درمانی و آنالوگ سولفورافان با هم ترکیب شوند، می‌تواند در فواصل زمانی 24 و 72 ساعت و با افزایش غلظت باعث کاهش رشد در رده‌های سلولی مذکور شود و این کاهش رشد، نسبت به زمانی که به‌تنهایی به‌کار برده شدند، بیشتر بود [12]. 
مطالعات ما همسو با مطالعات گذشته اثرات مثبت هارمین را به‌خصوص در ترکیب با دارو نشان می‌دهد [12]. نتایج ما نشان داد در میان غلظت‌های مختلف هارمین مقدار 20 میکروگرم باعث 50 درصد کشندگی می‌شود. برای فلورویوراسیل این عدد 35 میکروگرم و برای غلظت توأم 20/10 میکروگرم بود. 
بررسی تغییرات انجام‌شده روی هسته سلول‌ها با رنگ‌آمیزی DAPI نشان داد در گروه‌های آزمایشی هارمین با غلظت 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر، فلورویوراسیل با غلظت 35 میکروگرم بر میلی‌لیتر و هم‌افزایی با غلظت 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر از هارمین و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر از داروی فلورویوراسیل، هسته سلول‌ها قطعه قطعه و چروکیده شده که نشان‌دهنده آپوپتوز است. 
پیش‌تر در سال 2019 دینگ و همکاران، اثر مهاری هارمین روی سلول‌های سرطان سینه را با رنگ‌آمیزی فلورسنت DAPI بررسی کردند. نتایج این بررسی به این صورت بود که تراکم کروماتین و تکه‌تکه شدن هسته‌ای در سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7  تحت درمان با هارمین به مدت 24 ساعت مشهود بود که نشان‌دهنده آپوپتوز است [13]. در تحقیق دیگری که اثر هم‌افزایی رزوراترول و داروی فلورویوراسیل بررسی شده بود، اثر آپوپتوزی این ترکیب‌ها را روی سلول‌های سرطان پوست با رنگ‌آمیزی فلورسنت DAPI بررسی کردند. نتایج این بررسی نشانگر تراکم کروماتین و تکه تکه شدن هسته‌ای، در سلول‌های سرطان پوست تحت درمان با رزوراترول، داروی فلورویوراسیل و کاربرد به‌صورت هم‌زمان به مدت 24 ساعت مشهود بود، تکه تکه شدن و تراکم کروماتین که نشان‌دهنده آپوپتوز است در کاربرد هم‌زمان رزوزاترول و فلوراسیل بیشتر مشهود بود [14]. 
در پژوهش پیش‌رو نیز نتایج آزمون DAPI نشان داد سلول‌های رده‌ AsPC-1 که با هارمین، فلورویوراسیل و آزمایش توأم این دو هسته‌های تکه تکه شده و کروماتین‌های فشرده داشتند و این اثر آپوپتوزی در گروه آزمایش توأم نسبت به استفاده هر‌یک به‌تنهایی بیشتر بود که این نتایج با مطالعه ذکر‌شده همسو است. 
به‌نظر می‌رسد کاربرد توأم هارمین و دارو می‌تواند اثرات مؤثر داروی فلورویوراسیل را تا 3 برابر غلظت کمتر افزایش دهد. این نتیجه در جهت تغییر درمان از سمت شیمیایی کامل به طرف استفاده از مواد مؤثر گیاهی و هم‌زمان داروی شیمیایی برای اثربخشی بیشتر و جلوگیری از اثرات بالقوه درمان‌های شیمیایی تأکید می‌شود. به‌ویژه اینکه لی در این زمینه مطالعاتی در سال‌های 2020 و 2021 انجام داده است. 
طی پژوهشی که در سال 2020 لی و همکاران انجام دادند از هارمین به‌عنوان یک داروی ضد‌سرطان برای درمان سرطان کلورکتال در موش استفاده شد. لی و همکاران سلول‌های سرطانی کلورکتال را تحت آزمایش با هارمین به مدت 24 ساعت قرار دادند و سپس به‌وسیله رنگ‌آمیزی دوگانه Annexin V-FITC/PI مشاهده کردند که سلول‌های سرطانی تحت آزمایش با غلظت‌های خاصی از هارمین دچار آپوپتوز ثانویه شده است [15]. 
نتایج حاصل از پژوهش ما نیز همانند مطالعه لی و همکاران توانست ایجاد آپوپتوز در سلول‌های سرطانی رده AsPC-1 پانکراس را با استفاده از آزمون Annexin تأیید کند. مقاومت به داروهای شیمی‌درمانی از مشکلات درمان سرطان است، از‌جمله در سرطان کولون مقاومت به داروی فلورویوراسیل از مشکلات درمان این بیماری است. در‌این‌راستا در مطالعه‌ای که در سال 2021 انجام شد، ترکیب توأم کورکومول جدا‌شده از ریشه Rhizoma Curcumae و فلورویوراسیل بر رده سلولی سرطان کولون HCT116 که مقاوم به فلوراسیل است، بررسی شد. نتایج حاصل از آزمون Annexin V/PI نشان داد هنگام استفاده توأم از 2 ترکیب مذکور سلول‌ها دچار آپوپتوز می‌شوند و این میزان نسبت به استفاده به‌تنهایی از کورکومول بیشتر بود و مقاومت به فلورویوراسیل نیز برداشته شده است [16]. نتایج حاصل از مطالعه حاضر نیز همسو با مطالعه گائو و همکاران در زمان آزمایش توأم میزان آپوپتوز ایجاد‌شده نسبت به آزمایش به‌تنهایی بیشتر بود.
نتایج تغییرات بیان ژن‌های آپوپتوزی نشان داد هارمین، فلورویوراسیل و استفاده توأم این 2 ماده موجب افزایش معنادار بیان ژن‌های کاسپاز 3، کاسپاز 9 و Bax شود و در ارتباط با ژن p53 ترکیب هم‌افزایی موجب افزایش بیان این ژن شد. 
طی مطالعه‌ای که در سال 2011 توسط همسا و کوتن انجام شد به بررسی اثر آپوپتوزی هارمین بر سرطان پوست رده‌ سلولی B16F-10 پرداختند. در این پژوهش آن‌ها بیان ژن‌های آپوپتوزی همچون کاسپاز 3، p53, Bax, Bcl2, و کاسپاز 9 به روش RT-PCR  اندازه‌گیری کردند. نتایج این آزمون مشخص کرد هارمین با افزایش بیان ژن Bax و فعال کردن ژن‌های p53‌، کاسپاز 3، کاسپاز 9 و همچنین کاهش بیان ژن Bcl2 می‌توانند سبب ایجاد آپوپتوز در سلول‌های سرطان پوست شود [17]. 
در تحقیق حاضر مشابه و همسو با مطالعه ذکر‌شده هارمین، فلورویوراسیل و در حالت هم‌افزایی موجب افزایش بیان ژن‌های کاسپاز 3، Bax, و کاسپاز 9 شد و در حالت استفاده هم‌زمان هارمین و فلورویوراسیل موجب افزایش بیان ژن p53 شد. در مطالعه‌ای که در سال 2019 توسط لطیف و همکاران انجام شد، اثر هم‌افزایی رزوراترول و داروی فلورویوراسیل بر بیان ژن p53 روی رَت‌های دارای سرطان کولون ارزیابی و مشخص شد زمانی که به‌صورت ترکیبی از این 2 ماده و به‌صورت هم‌زمان استفاده شد، موجب تنظیم افزایشی در بیان ژن p53 شد [18]. همه این موارد بیانگر این نکته است که استفاده از فرآورده‌های گیاهی در کنار داروی شیمیایی می‌تواند اثربخشی درمان را در سلول‌های سرطانی مؤثرتر کند.​​​​​​​
نتیجه‌گیری
یافته‌های این تحقیق نشان می‌دهد هارمین و داروی فلورویوراسیل به‌تنهایی به‌دلیل داشتن خاصیت سیتوتوکسیسیته بالا سبب مهار و مرگ سلول‌های سرطانی پانکراس شده و هنگامی که به‌صورت هم‌زمان مصرف شد از میزان داروی فلورویوراسیل کاسته، اما همچنان سیتوتوکسیسیته بالایی را منجر شد که همچنان می‌تواند آپوپتوز را در سلول‌های سرطانی القا کرده و از رشد آن‌ها جلوگیری کند. این بدان معناست که حضور هارمین از میزان داروی شیمیایی می‌کاهد و بنابراین می‌تواند اثرات جانبی کاربرد داروی شیمیایی را به فراوانی کاهش دهد که البته نیاز به تحقیق و مطالعه بیشتر، خصوصاً در in vivo دارد. 
از موارد محدودیت پژوهش می‌توان به محدودیت در کاربرد مقدار داروی شیمیایی و میزان سمیت آن اشاره کرد. همچنین پیشنهاد می‌شود داروهای شیمیایی دیگر و همچنین ژن‌های کلیدی دیگر در مسیر سرطان‌زایی بررسی و مقایسه شوند.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
در این مقاله کلیه اصول اخلاقی در نظر گرفته شده است. شرکت کنندگان از هدف تحقیق و مراحل اجرای آن مطلع شدند. آنها همچنین از محرمانه بودن اطلاعات خود اطمینان داشتند و می‌توانستند هر زمان که بخواهند مطالعه را ترک کنند و در صورت تمایل، نتایج تحقیق در اختیار آنها قرار خواهد گرفت.

حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان‌نامه کارشناسی ارشد نویسنده اول و تصویب‌شده در دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی با کد 162374163 است و حامی مالی ندارد.

مشارکت نویسندگان
همه نویسندگان به طور یکسان در تهیه این مقاله مشارکت داشتند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
از تمام همکاران در گروه زیست‌شناسی و پژوهشکده خوارزمی تشکر و قدردانی می‌شود. 

References
1.Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2015; 65(2):87-108. [DOI:10.3322/caac.21262] [PMID]
2.Kanji ZS, Gallinger S. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Canadian Medical Association Journal. 2013; 185(14):1219-26. [Link]
3.Salem AA, Mackenzie GG. Pancreatic cancer: A critical review of dietary risk. Nutrition Research. 2018; 52:1-13. [DOI:10.1016/j.nutres.2017.12.001] [PMID]
4.Sara JD, Kaur J, Khodadadi R, Rehman M, Lobo R, Chakrabarti S, et al. 5-fluorouracil and cardiotoxicity: A review. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 2018; 10:1758835918780140. [DOI:10.1177/1758835918780140] [PMID] [PMCID]
5.Rouanet M, Lebrin M, Gross F, Bournet B, Cordelier P, Buscail L. Gene therapy for pancreatic cancer: Specificity, issues and hopes. International Journal of Molecular Sciences. 2017; 18(6):1231. [DOI:10.3390/ijms18061231] [PMID] [PMCID]
6.Shahbazfàr AA, Zare P, Mohammadpour H, Tayefi-Nasrabadi H, Emami SJ. Combination therapy enhanced the antitumor activity of artemisinin-iron in lung cancer Calu-6 cells. European Journal of Oncology. 2017; 22(1):31-7. [Link]
7.Cheng MH, Hsieh CL, Wang CY, Tsai CC, Kuo CC. Complementary therapy of traditional Chinese medicine for blood sugar control in a patient with type 1 diabetes. Complementary Therapies in Medicine. 2017; 30:10-13. [DOI:10.1016/j.ctim.2016.09.007] [PMID]
8.Ergin V, Hariry RE, Karasu C. Carbonyl stress in aging process: Role of vitamins and phytochemicals as redox regulators. Aging and Disease. 2013; 4(5):276-94. [DOI:10.14336/AD.2013.0400276] [PMID] [PMCID]
9.Javeed M, Rasul A, Hussain G, Jabeen F, Rasool B, Shafiq N, et al. Harmine and its derivatives: Biological activities and therapeutic potential in human diseases. Bangladesh Journal of Pharmacology. 2018; 13(3):203-13. [DOI:10.3329/bjp.v13i3.34990]
10.Balaji N, Devy AS, Sumathi MK, Vidyalakshmi S, Kumar GS, D’Silva S. Annexin v - affinity assay - apoptosis detection system in granular cell ameloblastoma. Journal of International Oral Health. 2013; 5(6):25-30. [PMID] [PMCID]
11.Gao J, Zhu H, Wan H, Zou X, Ma X, Gao G. Harmine suppresses the proliferation and migration of human ovarian cancer cells through inhibiting ERK/CREB pathway. Oncology Reports. 2017; 38(5):2927-34. [DOI:10.3892/or.2017.5952] [PMID]
12.M Milczarek M, Pogorzelska A, Wiktorska K. Synergistic interaction between 5-FU and an analog of sulforaphane-2-oxohexyl isothiocyanate-in an in vitro colon cancer model. Molecules. 2021; 26(10):3019. [DOI:10.3390/molecules26103019] [PMID] [PMCID]
13.Ding Y, He J, Huang J, Yu T, Shi X, Zhang T, et al. Harmine induces anticancer activity in breast cancer cells via targeting TAZ. International Journal of Oncology. 2019; 54(6):1995-2004. [DOI:10.3892/ijo.2019.4777]
14.Dun J, Chen X, Gao H, Zhang Y, Zhang H, Zhang Y. Resveratrol synergistically augments anti-tumor effect of 5-FU in vitro and in vivo by increasing S-phase arrest and tumor apoptosis. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 2015; 240(12):1672-81. [DOI:10.1177/1535370215573396] [PMID] [PMCID]
15.Li Z, Chen L, He C, Han Y, Han M, Zhang Y, et al. Improving anti-tumor outcomes for colorectal cancer therapy through in situ thermosensitive gel loading harmine. American Journal of Translational Research. 2020; 12(5):1658-71. [PMID] [PMCID]
16.Gao J, Hou D, Hu P, Mao G. Curcumol increases the sensitivity of colon cancer to 5-FU by regulating Wnt/β-catenin signaling. Translational Cancer Research. 2021; 10(5):2437-50. [DOI:10.21037/tcr-21-689] [PMID] [PMCID]
17.Hamsa TP, Kuttan G. Harmine activates intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis in B16F-10 melanoma. Chinese Medicine. 2011; 6(1):11 [DOI:10.1186/1749-8546-6-11] [PMID] [PMCID]
18.Abdel Latif Y, El-Bana M, Hussein J, El-Khayat Z, Farrag AR. Effects of resveratrol in combination with 5-fluorouracil on N-methylnitrosourea-induced colon cancer in rats. Comparative Clinical Pathology. 2019; 28(5):1351-62. [DOI:10.1007/s00580-019-02967-2]
19.Diao E, Ren D, Liu T, Zhang J, Hu W, Hou H. Ozone detoxification of patulin in aqueous solution and cytotoxic evaluation using human hepatic carcinoma cells. Toxicon. 2018; 155:21-26. [DOI:10.1016/j.toxicon.2018.10.004] [PMID]
20.Truter D, Chellan N, Strijdom H, Webster I, Rawstorne J, Kotzé SH. Histomorphological changes in the pancreas and kidney and histopathological changes in the liver in male Wistar rats on antiretroviral therapy and melatonin treatment. Acta Histochemica. 2018; 120(4):347-55. [DOI:10.1016/j.acthis.2018.03.006] [PMID]