آدرس ایمیل خود را وارد نمایید
ثبت
پیام خود را بنویسید
دوره 13، شماره 4 - ( 11-1402 )
جلد 13 شماره 4 صفحات 73-65 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mousavi H, Mohammadzadeh E, Badri H, Najafi E, Mousavi Tekantapeh G, Nazari S. Investigating the Antibacterial Properties of the Hydroalcoholic Extract of Pomegranate Peel and Phenol on a Group of Intestinal Bacteria in Vitro. cmja 2024; 13 (4) :65-73
URL: http://cmja.arakmu.ac.ir/article-1-970-fa.html
URL: http://cmja.arakmu.ac.ir/article-1-970-fa.html
موسوی حیدر، محمدزاده احسان، بدری هاجر، نجفی اسماعیل، موسوی تکانتپه گلچین، نظری شهرام. بررسی خصوصیات ضدباکتریایی عصاره هیدرو الکلی پوست انار و فنل بر روی گروهی از باکتری‌های روده‌ای در محیط آزمایشگاهی. فصلنامه طب مکمل. 1402; 13 (4) :65-73
حیدر موسوی1 
، احسان محمدزاده1 ، هاجر بدری2 ، اسماعیل نجفی3 ، گلچین موسوی تکانتپه4 ، شهرام نظری* 5
، احسان محمدزاده1 ، هاجر بدری2 ، اسماعیل نجفی3 ، گلچین موسوی تکانتپه4 ، شهرام نظری* 5
1- کارشناسی، گروه بهداشت عمومی، عضو کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشکده علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران
2- کارشناسی ارشد، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران
3- مربی، گروه بهداشت عمومی، دانشگاه علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران
4- کارشناسی، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه، ارومیه، ایران
5- استادیار، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران ،shahramnazari73@yahoo.com
2- کارشناسی ارشد، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران
3- مربی، گروه بهداشت عمومی، دانشگاه علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران
4- کارشناسی، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی ارومیه، ارومیه، ایران
5- استادیار، گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده علوم پزشکی خلخال، خلخال، ایران ،
متن کامل [PDF 720 kb]
(269 دریافت)
| چکیده (HTML) (448 مشاهده)
مقایسه خواص ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل
به منظور مقایسه عصاره پوست انار با فنل طبق روش MIC و MBC، رقت‌های یک دوم، یک چهارم، یک هشتم، یک شانزدهم، یک سی و دوم، یک شصت و چهارم، یک صد و بیست و هشتم، یک دویست و پنجاه و ششم عصاره پوست انار تهیه و همچنین فنل مادر که از شرکت مرک خریداری شده بود با غلظت‌های مختلف (5000، 2500، 1250 و 675 میلی‌گرم در لیتر) در لوله‌های آزمایش تهیه گردید. فنل مادر از شرکت مرک خریداری شد. به هر کدام از چاهک‌ها تعداد معینی از باکتری‌های (CFU/ml 104×5/7) مورد آزمایش اضافه شد. سپس در زمان‌های 5، 10 و 15 دقیقه نمونه‌ای به اندازه 10 میکرولیتر از هر یک چاهک برداشته شد و در محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شد. و سپس در دستگاه انکوباتور به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس قرار داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگرداد نمونه‌ها از نظر رشد تعداد باکتری‌ها مورد مقایسه قرار گرفتند.
یافته‌ها
تعیین حداقل غلظت بازدارندگی ((MIC و حداقل غلظت کشندگی (MBC)
مقدار MIC و MBC عصاره پوست انار برای باکتری‌های شیگلا دیسانتری و اشرشیاکلی به ترتیب در رقت‌های 5/12% و 25%، کلبسیلا پنومونیه در رقت 25% و آنتروباکتر آئروژنز به ترتیب در رقت‌های 25/6% و 25% بدست آورده شد. در جدول 2 اثرات ضدباکتریایی رقت‌های مختلف عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های مورد نظر نشان داده شده است.
جدول 2. تأثیر رقت‌های مختلف عصاره پوست انار بر رشد باکتری
شکل 3. قطر هاله عدم رشد باکتری‌های شیگلا دیسانتری، کلبسیلا پنومونیه و انتروباکتر آئروژنز (الف) و اشرشیا کلی (ب)
شکل 4. نمونه‌ای از تصاویر مربوط به مقایسه خاصیت ضدباکتریایی عصاره پوست انار با فنل
متن کامل: (328 مشاهده)
مقدمه
استفاده از ترکیبات گیاهی برای کنترل بیماری‌های عفونی به زمان‌های خیلی دور بر می‌گردد ولی با پیشرفت علم پزشکی و گشترش تولید داروهای آنتی‌بیوتیکی گرایش به این ترکیبات کاهش پیدا کرده است (1, 2). در اوایل قرن بیستم کشف داروهای ضدمیکروبی یا آنتی‌بیوتیک‌ها نقطه عطف تاریخی در زمینه داروسازی بود که باعث کاهش چشم‌گیر مرگ و میر بیماری‌های عفونی شد که در آن زمان علت اصلی مرگ ومیر در سراسر جهان بشمار می‌رفت (3, 4). در سال‌های اخیر آنتی بیوتیک‌ها نقش اساسی در کنترل عفونت‌ها داشته‌اند ولی استفاده نادرست و بیش از حد آنها باعث ایجاد عوارض جانبی ناخواسته و ایجاد باکترهای مقاوم به چندین دارو شده است (5). استفاده از غلظت‌های بالای آنتی‌بیوتیک‌ها برای از بین بردن باکتری‌های مقاوم، باعث ایجاد مسمومیت و نهایتاً باعث افزایش درصد مرگ و میر در بیماران می‌شود (6). بنابراین بایستی اقداماتی به منظور کاهش عوارض جانبی و مقاومت باکتریایی صورت گیرد که یکی از این راه‌ها کشف داروهای جدید بر پایه‌ی ترکیبات گیاهی می‌باشد که می‌تواند یک جایگزین مناسب در نظر گرفته شود (7).
انار گیاهی با سابقه دارویی کهن می‌باشد که تحقیقات روی خواص دارویی آن به خاطر نیاز روز افزون برای استفاده از مواد ضدمیکروبی طبیعی مشتق شده از منابع گیاهی در حال افزایش می‌باشد (8). بخش‌های مختلف این گیاه همچون دانه، پوست، برگ و گل ترکیبات شیمیایی متعددی از قبیل ترکیبات فنلی، قندها، آمینواسیدها، استرول‌ها و...دارند که خواص دارویی متفاوتی از خود نشان می‌دهند (9). فعالیت ضدمیکروبی عصاره پوست انار به علت حضور مواد فنلیک بخصوص الاژیک اسید و پونیکالاژین می‌باشد. این ترکیبات با نسبت بیشتری در پوست میوه انار یافت می‌شوند (10). ترکیبات فنلی موجود در پوست انار از طریق چند مکانیسم مختلف خاصیت ضدمیکروبی ایجاد می‌کنند. ترکیبات فنلی قادرند با پروتئین‌های سلولی باکتری‌ها واکنش داده و در ساختار و عملکرد دیواره سلولی تغییر ایجاد کنند و یا باعث دناتوره شدن برخی آنزیم‌های باکتری‌ها شوند. علاوه بر آن ترکیبات فنلی با برخی از مواد مغذی محیط مانند کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، ویتامین‌ها و مواد معدنی تشکیل کمپلکس داده و آنها را از دسترس باکتری‌ها خارج می‌کنند (11). ظهور مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام به سال‌های اولیه کشف مقاومت نسبت به اولین آنتی بیوتیک (پنی سیلین) برمی گردد (12). بتالاکتامازها آنزیم‌های تخریب کننده‌ای هستند که به آنتی بیوتیک‌های بتالاکتام حمله می‌کنند. آنزیم‌های بتالاکتاماز در باکتری‌ها متنوع‌اند و دائماً در حال جهش هستند. تولید آنزیم‌های بتالاکتاماز توسط خانواده آنتروباکتریاسه یکی از مشکلات مهم بهداشتی در سطح دنیاست (13).
خانواده آنتروباکتریاسه به ویژه باکتری اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه باعث ایجاد انواعی از عفونت‌ها در افراد مختلف به ویژه نوزادان می‌شوند (14)، که می‌توان به پنومونی (15)، سپتی سمی (16)، اسهال، ایجاد آبسه در کبد، اندوفتالمیت، مننژیت (14)، عفونت‌های ادراری و باکتریایی (17) اشاره نمود.
همچنین امروزه درمان عفونت نوزادان آلوده به ارگانیسم‌های مقاوم به چندین دارو، به یک مشکل مهم جهانی تبدیل شده است (5) گونه‌های شیگلا باسیل‌های گرم منفی متعلق به خانواده انتروباکتریاسه هستند که به عنوان عامل اصلی اسهال و دیسانتری شناخته شده‌اند (18). شیگلا یک مشکل عمده بهداشت عمومی در کشورهای در حال توسعه می‌باشد. شیگلوزیس یک بیماری منتقله از طریق غذا و یک خطر جدی در سلامت انسان است که توسط باکتری شیگلا ایجاد می‌شود (19). در سطح جهانی شیگلوز سبب مرگ بیش از یک میلیون نفر در سال در میان تمام گروه‌های سنی در کشورهای در حال توسعه می‌گردد (5). انتروباکتر یکی از اعضای خانواده آنتروباکتریاسه می‌باشد. دستگاه تنفسی و دستگاه ادراری شایع‌ترین مکان عفونت انتروباکتر است (20). از میان اعضای این جنس انتروباکترآئروژنز به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب شناخته شده است که همانند بسیاری از اعضای خانواده آنتروباکتریاسه قادر به ایجاد عفونت‌های دستگاه ادراری و عفونت‌های فرصت طلب در بیماران بستری شده در بیمارستان می‌باشد (21). درحال حاضر سویه‌های این باکتری به بتالاکتام‌ها، سفتازیدم و نورفلوکساسین مقاوم شده‌اند (7, 22).
با توجه به نقش باکتری‌های نام‌برده درایجاد بیماری‌های عفونی و افزایش مقاومت آنها نسبت به آنتی بیوتیک‌ها دراثر مصرف داروهای ضدمیکروبی و از طرفی به دلیل کمتر بودن عوارض، سادگی استفاده و ارزان بودن گیاهان دارویی تحقیقات در این زمینه ضروری می‌باشد. تاکنون مطالعه‌ای در زمینه تعیین حداقل غلظت کشندگی، بازدارندگی، قطر هاله عدم رشد عصاره پوست انار و مقایسه آن با خاصیت ضد باکتریایی فنل بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری، انتروباکتر آئروژنز، کلبسیلا پنومونیه و اشرشیاکلی انجام نشده است.
مقایسه خاصیت ضد باکتریایی مواد با فنل به عنوان شاخصی برای تعیین میزان اثر ضدباکتریایی آن معرفی شده است، که در مورد عصاره گیاهان ضروری است به این موضوع توجه و اهمیت داده شود. به همین دلیل در این مطالعه شاخص مذکور نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. بنابراین هدف از این مطالعه تعیین حداقل غلظت بازدارندگی، کشندگی و قطر هاله عدم رشد عصاره پوست انار و مقایسه آن با فنل بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری، انتروباکتر آئروژنز، کلبسیلا پنومونیه و اشرشیاکلی در محیط آزمایشگاهی می‌باشد.
روش کار
تهیه عصاره پوست انار
پس از تهیه میوه انار از روستای نمهیل شهرستان خلخال واقع در استان اردبیل، پوست آن در محیط استریل آزمایشگاهی جدا و خشک گردید (شکل1 - الف). مقدار 10 گرم از آن را در یک هاون استریل پودر کرده (شکل1 - ب)سپس آن را در یک ارلن مدرج ریخته و مقدار 50 میلی لیتر اتانول 100 درصد آزمایشگاهی به آن اضافه گردید (شکل1 - ج). سپس 24 ساعت در دستگاه همزن مغناطیسی اختلاط داده شد. سپس با استفاده از قیف بوخنر دارای کاغذ صافی واتمن شماره 42 و پمپ خلاء (مدل Spar Max TC501V)، اجزای باقی مانده از عصاره جدا گردید(شکل1 - د). سپس 20 میلی لیتر آب مقطر به محلول مورد نظر اضافه و دوباره در دستگاه همزن مغناطیسی که دمای آن در 80 درجه سانتیگراد تنظیم شده بود، قرار داده شد تا الکل به طور کامل از راکتور خارج شود (شکل1 - و). برای اطمینان از خارج شدن همه الکل افزوده شده، فرآیند تبخیر تا زمانی ادامه داده شد که حجم محلول ثابت گردد.
انار گیاهی با سابقه دارویی کهن می‌باشد که تحقیقات روی خواص دارویی آن به خاطر نیاز روز افزون برای استفاده از مواد ضدمیکروبی طبیعی مشتق شده از منابع گیاهی در حال افزایش می‌باشد (8). بخش‌های مختلف این گیاه همچون دانه، پوست، برگ و گل ترکیبات شیمیایی متعددی از قبیل ترکیبات فنلی، قندها، آمینواسیدها، استرول‌ها و...دارند که خواص دارویی متفاوتی از خود نشان می‌دهند (9). فعالیت ضدمیکروبی عصاره پوست انار به علت حضور مواد فنلیک بخصوص الاژیک اسید و پونیکالاژین می‌باشد. این ترکیبات با نسبت بیشتری در پوست میوه انار یافت می‌شوند (10). ترکیبات فنلی موجود در پوست انار از طریق چند مکانیسم مختلف خاصیت ضدمیکروبی ایجاد می‌کنند. ترکیبات فنلی قادرند با پروتئین‌های سلولی باکتری‌ها واکنش داده و در ساختار و عملکرد دیواره سلولی تغییر ایجاد کنند و یا باعث دناتوره شدن برخی آنزیم‌های باکتری‌ها شوند. علاوه بر آن ترکیبات فنلی با برخی از مواد مغذی محیط مانند کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، ویتامین‌ها و مواد معدنی تشکیل کمپلکس داده و آنها را از دسترس باکتری‌ها خارج می‌کنند (11). ظهور مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام به سال‌های اولیه کشف مقاومت نسبت به اولین آنتی بیوتیک (پنی سیلین) برمی گردد (12). بتالاکتامازها آنزیم‌های تخریب کننده‌ای هستند که به آنتی بیوتیک‌های بتالاکتام حمله می‌کنند. آنزیم‌های بتالاکتاماز در باکتری‌ها متنوع‌اند و دائماً در حال جهش هستند. تولید آنزیم‌های بتالاکتاماز توسط خانواده آنتروباکتریاسه یکی از مشکلات مهم بهداشتی در سطح دنیاست (13).
خانواده آنتروباکتریاسه به ویژه باکتری اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه باعث ایجاد انواعی از عفونت‌ها در افراد مختلف به ویژه نوزادان می‌شوند (14)، که می‌توان به پنومونی (15)، سپتی سمی (16)، اسهال، ایجاد آبسه در کبد، اندوفتالمیت، مننژیت (14)، عفونت‌های ادراری و باکتریایی (17) اشاره نمود.
همچنین امروزه درمان عفونت نوزادان آلوده به ارگانیسم‌های مقاوم به چندین دارو، به یک مشکل مهم جهانی تبدیل شده است (5) گونه‌های شیگلا باسیل‌های گرم منفی متعلق به خانواده انتروباکتریاسه هستند که به عنوان عامل اصلی اسهال و دیسانتری شناخته شده‌اند (18). شیگلا یک مشکل عمده بهداشت عمومی در کشورهای در حال توسعه می‌باشد. شیگلوزیس یک بیماری منتقله از طریق غذا و یک خطر جدی در سلامت انسان است که توسط باکتری شیگلا ایجاد می‌شود (19). در سطح جهانی شیگلوز سبب مرگ بیش از یک میلیون نفر در سال در میان تمام گروه‌های سنی در کشورهای در حال توسعه می‌گردد (5). انتروباکتر یکی از اعضای خانواده آنتروباکتریاسه می‌باشد. دستگاه تنفسی و دستگاه ادراری شایع‌ترین مکان عفونت انتروباکتر است (20). از میان اعضای این جنس انتروباکترآئروژنز به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب شناخته شده است که همانند بسیاری از اعضای خانواده آنتروباکتریاسه قادر به ایجاد عفونت‌های دستگاه ادراری و عفونت‌های فرصت طلب در بیماران بستری شده در بیمارستان می‌باشد (21). درحال حاضر سویه‌های این باکتری به بتالاکتام‌ها، سفتازیدم و نورفلوکساسین مقاوم شده‌اند (7, 22).
با توجه به نقش باکتری‌های نام‌برده درایجاد بیماری‌های عفونی و افزایش مقاومت آنها نسبت به آنتی بیوتیک‌ها دراثر مصرف داروهای ضدمیکروبی و از طرفی به دلیل کمتر بودن عوارض، سادگی استفاده و ارزان بودن گیاهان دارویی تحقیقات در این زمینه ضروری می‌باشد. تاکنون مطالعه‌ای در زمینه تعیین حداقل غلظت کشندگی، بازدارندگی، قطر هاله عدم رشد عصاره پوست انار و مقایسه آن با خاصیت ضد باکتریایی فنل بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری، انتروباکتر آئروژنز، کلبسیلا پنومونیه و اشرشیاکلی انجام نشده است.
مقایسه خاصیت ضد باکتریایی مواد با فنل به عنوان شاخصی برای تعیین میزان اثر ضدباکتریایی آن معرفی شده است، که در مورد عصاره گیاهان ضروری است به این موضوع توجه و اهمیت داده شود. به همین دلیل در این مطالعه شاخص مذکور نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. بنابراین هدف از این مطالعه تعیین حداقل غلظت بازدارندگی، کشندگی و قطر هاله عدم رشد عصاره پوست انار و مقایسه آن با فنل بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری، انتروباکتر آئروژنز، کلبسیلا پنومونیه و اشرشیاکلی در محیط آزمایشگاهی می‌باشد.
روش کار
تهیه عصاره پوست انار
پس از تهیه میوه انار از روستای نمهیل شهرستان خلخال واقع در استان اردبیل، پوست آن در محیط استریل آزمایشگاهی جدا و خشک گردید (شکل1 - الف). مقدار 10 گرم از آن را در یک هاون استریل پودر کرده (شکل1 - ب)سپس آن را در یک ارلن مدرج ریخته و مقدار 50 میلی لیتر اتانول 100 درصد آزمایشگاهی به آن اضافه گردید (شکل1 - ج). سپس 24 ساعت در دستگاه همزن مغناطیسی اختلاط داده شد. سپس با استفاده از قیف بوخنر دارای کاغذ صافی واتمن شماره 42 و پمپ خلاء (مدل Spar Max TC501V)، اجزای باقی مانده از عصاره جدا گردید(شکل1 - د). سپس 20 میلی لیتر آب مقطر به محلول مورد نظر اضافه و دوباره در دستگاه همزن مغناطیسی که دمای آن در 80 درجه سانتیگراد تنظیم شده بود، قرار داده شد تا الکل به طور کامل از راکتور خارج شود (شکل1 - و). برای اطمینان از خارج شدن همه الکل افزوده شده، فرآیند تبخیر تا زمانی ادامه داده شد که حجم محلول ثابت گردد.
سویه‌های باکتری
سویه‌های باکتری استفاده شده در پژوهش کنونی شامل سویه استاندارد کلبسیلا پنومونیه (ATCC:10031)، اشرشیاکلی (ATCC: 23591)، شیگلا دیسانتری (ATCC:12022)، انتروباکتر آئروژنز (ATCC:13048) می‌باشد که از مرکز پژوهش‌های صنعتی ایران تهیه گردید. تمامی سویه‌های باکتریایی خریـداری شده، در محیط کشت نوترینت براث در شرایط هوازی و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرماگذاری شدند. سپس با لوپ استریل از محیط کشت نوترینت براث مقداری برداشته و بر روی محیط‌های کشت اختصاصی هر باکتری، به‌حالت خطی کشت داده شد. سپس پلیت‌های تلقیح شده در گرمخانه با دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت قرار داده شدند (23).
تهیه استاندارد مک فارلند
در این پژوهش، استاندارد مک‌فارلند به‌عنوان مرجعی برای مطابقت دادن کدورت ناشی از سوسپانسیون باکتری استفاده شد. مواد مورد استفاده برای تهیه استاندارد نیم مک‌فارلند شامل: باریم کلرید (BaCl2.2H2O) دهیدراته و اسید سولفوریک (H2SO4) بوده که از شرکت Merck تهیه گردید. با مخلوط نمودن 05/0 میلی لیتر باریم کلرید دهیدارته (BaCl22H2O) 175/%1 با 95/9 میلی لیتر اسید سولفوریک (H2SO4) %1، استاندارد نیم مک‌فارلند تهیه گردید. با مخلوط این دو ترکیب رسوب سولفات باریم که سبب ایجاد کدورت در محلول می‌شود، به‌وجود آمد. جذب نوری کدورت ایجاد شده توسط محلول نیم‌مک فارلند در طول موج 610 نانومتر به وسیله اسپکتروفتومتر (مدل Hach) اندازه گیری گردید. از آنجایی که تعداد باکتری تلقیح شده یکی از مهمترین متغیرهایی است که بر نتیجه این پژوهش اثر می‌گذارد، تراکم سوسپانسیون میکروبی تلقیحی باید استاندارد باشد. بدین‌منظور برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، از کشت تازه و جوان باکتری با استفاده از لوپ استریل چند کلنی به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل انتقال داده شد. کلنی‌های باکتری تا حدی به سرم فیزیولوژی اضافه گردید تا کدورت ایجاد شده توسط باکتری‌ها معادل با کدورت اندازه گیری شده در لوله استاندارد 5/0 مک فارلند باشد. با توجه به اینکه غلظت باکتریایی نیم مک فارلند برابر 108×5/1 میلی لیتر می‌باشد، برای بدست آوردن سایر رقت‌های باکتریایی از رقیق سازی استفاده گردید. این عملیات برای هر چهار باکتری مورد مطالعه به طور جداگانه انجام گردید. تمامی آزمایش‌ها برابر با دستورالعمل‌های موسسه استاندارد و آزمایشگاه پزشکی (CLSI) انجام شد (24).
تعیین حداقل غلظت بازدارندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره پوست انار
آزمایشات حداقل غلظت بازدارندگی MIC و MBC با استفاده از روش رقیق سازی میکرو بر اساس روش توصیه شده توسط CLSI انجام گردید. در این روش از میکرو چاهک‌ها (شکل 2) برای تعیین اثر ضدباکتریایی غلظت‌های مختلف عصاره پوست انار استفاده گردید. یک چاهک شاهد برای کنترل مثبت و یک چاهک شاهد برای کنترل منفی استفاده شد. شاهد مثبت حاوی محیط کشت نوترینت براث و باکتری که ماده ضد باکتریایی به آن اضافه نشده است. همچنین شاهد منفی فقط حاوی محیط کشت می‌باشد. برای تعیین مقدار دقیق MIC و MBC عصاره پوست انار در مقابل هر باکتری، آزمایشات با رقت‌های مختلف (50%،%25، 5/%12، 25/%6، 125/%3 ...) عصاره به صورت رقیق سازی سریالی انجام داده شد. به چاهک‌های ردیف A (شکل 2) که شامل 12 چاهک می‌باشد، به هر چاهک 100 میکرولیتر محیط کشت نوترینت براث استریل ریخته شد سپس از عصاره تهیه شده، 100 میکرولیتر به چاهک شماره A1 ریخته شد و چندین بار پیپت گردید و سپس از چاهک A1، 100 میکرولیتر برداشت شد و به چاهک A2، انتقال داده شد، این عملیات رقیق سازی تا چاهک A10، انجام داده شد و غلظت عصاره پوست انار در خانه A10 به اندازه 10(5/0) برابر غلظت اولیه کاهش یافت. چاهک‌های A11 و A12 به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر گرفته شد. سپس 5 میکرولیتر از محلول باکتری با غلظت یک دهم برابر نیم مک فارلند به همه چاهک‌ها به جزء چاهک کنترل منفی اضافه گردید. سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس در گرمخانه قرار داده شد. پس از طی زمان گرماگذاری، چاهک‌ها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتری تلقیح شده بررسی شدند. چاهکی با کمترین غلظت از عصاره پوست انار که رشد باکتری در آن مشاهده نشد، به عنوان MIC تعیین گردید. برای تعیین MBC عصاره پوست انار، از چاهک‌هایی که رشد در آنها مشاهده نشده بود 10 میکرولیتر بر روی محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شدند و در گرمخانه در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرماگذاری شدند. بعد از گرماگذاری پلیت مربوط به چاهکی که حاوی کمترین غلظت از عصاره پوست انار در آن بود و رشد باکتری برابر یا کمتر از 11 کلنی در آن مشاهده شد، به عنوان MBC در نظر گرفته شد. تمامی این عملیات در زیر هود استریل انجام گردید.
سویه‌های باکتری استفاده شده در پژوهش کنونی شامل سویه استاندارد کلبسیلا پنومونیه (ATCC:10031)، اشرشیاکلی (ATCC: 23591)، شیگلا دیسانتری (ATCC:12022)، انتروباکتر آئروژنز (ATCC:13048) می‌باشد که از مرکز پژوهش‌های صنعتی ایران تهیه گردید. تمامی سویه‌های باکتریایی خریـداری شده، در محیط کشت نوترینت براث در شرایط هوازی و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرماگذاری شدند. سپس با لوپ استریل از محیط کشت نوترینت براث مقداری برداشته و بر روی محیط‌های کشت اختصاصی هر باکتری، به‌حالت خطی کشت داده شد. سپس پلیت‌های تلقیح شده در گرمخانه با دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت قرار داده شدند (23).
تهیه استاندارد مک فارلند
در این پژوهش، استاندارد مک‌فارلند به‌عنوان مرجعی برای مطابقت دادن کدورت ناشی از سوسپانسیون باکتری استفاده شد. مواد مورد استفاده برای تهیه استاندارد نیم مک‌فارلند شامل: باریم کلرید (BaCl2.2H2O) دهیدراته و اسید سولفوریک (H2SO4) بوده که از شرکت Merck تهیه گردید. با مخلوط نمودن 05/0 میلی لیتر باریم کلرید دهیدارته (BaCl22H2O) 175/%1 با 95/9 میلی لیتر اسید سولفوریک (H2SO4) %1، استاندارد نیم مک‌فارلند تهیه گردید. با مخلوط این دو ترکیب رسوب سولفات باریم که سبب ایجاد کدورت در محلول می‌شود، به‌وجود آمد. جذب نوری کدورت ایجاد شده توسط محلول نیم‌مک فارلند در طول موج 610 نانومتر به وسیله اسپکتروفتومتر (مدل Hach) اندازه گیری گردید. از آنجایی که تعداد باکتری تلقیح شده یکی از مهمترین متغیرهایی است که بر نتیجه این پژوهش اثر می‌گذارد، تراکم سوسپانسیون میکروبی تلقیحی باید استاندارد باشد. بدین‌منظور برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، از کشت تازه و جوان باکتری با استفاده از لوپ استریل چند کلنی به لوله حاوی سرم فیزیولوژی استریل انتقال داده شد. کلنی‌های باکتری تا حدی به سرم فیزیولوژی اضافه گردید تا کدورت ایجاد شده توسط باکتری‌ها معادل با کدورت اندازه گیری شده در لوله استاندارد 5/0 مک فارلند باشد. با توجه به اینکه غلظت باکتریایی نیم مک فارلند برابر 108×5/1 میلی لیتر می‌باشد، برای بدست آوردن سایر رقت‌های باکتریایی از رقیق سازی استفاده گردید. این عملیات برای هر چهار باکتری مورد مطالعه به طور جداگانه انجام گردید. تمامی آزمایش‌ها برابر با دستورالعمل‌های موسسه استاندارد و آزمایشگاه پزشکی (CLSI) انجام شد (24).
تعیین حداقل غلظت بازدارندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره پوست انار
آزمایشات حداقل غلظت بازدارندگی MIC و MBC با استفاده از روش رقیق سازی میکرو بر اساس روش توصیه شده توسط CLSI انجام گردید. در این روش از میکرو چاهک‌ها (شکل 2) برای تعیین اثر ضدباکتریایی غلظت‌های مختلف عصاره پوست انار استفاده گردید. یک چاهک شاهد برای کنترل مثبت و یک چاهک شاهد برای کنترل منفی استفاده شد. شاهد مثبت حاوی محیط کشت نوترینت براث و باکتری که ماده ضد باکتریایی به آن اضافه نشده است. همچنین شاهد منفی فقط حاوی محیط کشت می‌باشد. برای تعیین مقدار دقیق MIC و MBC عصاره پوست انار در مقابل هر باکتری، آزمایشات با رقت‌های مختلف (50%،%25، 5/%12، 25/%6، 125/%3 ...) عصاره به صورت رقیق سازی سریالی انجام داده شد. به چاهک‌های ردیف A (شکل 2) که شامل 12 چاهک می‌باشد، به هر چاهک 100 میکرولیتر محیط کشت نوترینت براث استریل ریخته شد سپس از عصاره تهیه شده، 100 میکرولیتر به چاهک شماره A1 ریخته شد و چندین بار پیپت گردید و سپس از چاهک A1، 100 میکرولیتر برداشت شد و به چاهک A2، انتقال داده شد، این عملیات رقیق سازی تا چاهک A10، انجام داده شد و غلظت عصاره پوست انار در خانه A10 به اندازه 10(5/0) برابر غلظت اولیه کاهش یافت. چاهک‌های A11 و A12 به ترتیب به عنوان کنترل مثبت و کنترل منفی در نظر گرفته شد. سپس 5 میکرولیتر از محلول باکتری با غلظت یک دهم برابر نیم مک فارلند به همه چاهک‌ها به جزء چاهک کنترل منفی اضافه گردید. سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس در گرمخانه قرار داده شد. پس از طی زمان گرماگذاری، چاهک‌ها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتری تلقیح شده بررسی شدند. چاهکی با کمترین غلظت از عصاره پوست انار که رشد باکتری در آن مشاهده نشد، به عنوان MIC تعیین گردید. برای تعیین MBC عصاره پوست انار، از چاهک‌هایی که رشد در آنها مشاهده نشده بود 10 میکرولیتر بر روی محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شدند و در گرمخانه در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت گرماگذاری شدند. بعد از گرماگذاری پلیت مربوط به چاهکی که حاوی کمترین غلظت از عصاره پوست انار در آن بود و رشد باکتری برابر یا کمتر از 11 کلنی در آن مشاهده شد، به عنوان MBC در نظر گرفته شد. تمامی این عملیات در زیر هود استریل انجام گردید.
روش دیسک آگار دیفیوژن
از کدورت سوسپانسیون میکروبی تهیه شده مطابق با استاندارد نیم مک فارلند در پلیت‌های حاوی محیط کشت نوترینت آگار بوسیله‌ی سواپ استریل به صورت یکنواخت کشت داده شدند، سپس دیسک‌های خالی (Blank disk) 6 میلی متری در شرایط کاملاً استریل به 50 میکرولیتر از عصاره آغشته و به منظور خشک شدن به مدت 30 دقیقه در گرمخانه در دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شدو سپس دیسک‌ها در داخل پلیت‌ها به فاصله مناسب قرار گرفته و پس از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس، قطر هاله‌ی عدم رشد بوسیله خط کش برای هر کدام از آنها اندازه‌گیری و بر حسب میلیمتر گزارش گردید. تمامی این عملیات برای سویه‌های باکتریایی مورد مطالعه به صورت جداگانه انجام گردید.
برای همه نمونه‌های مورد آزمایش یک نمونه به عنوان نمونه شاهد استفاده گردید (حاوی محیط کشت نوترینت براث و باکتری‌ها، بدون عصاره پوست انار). تمامی آزمایشات حذف باکتری‌ها در محیط آبی با خصوصیات PBS انجام گردید (جدول1).
جدول 1. خصوصیات بافر فسفات نرمال سالین
از کدورت سوسپانسیون میکروبی تهیه شده مطابق با استاندارد نیم مک فارلند در پلیت‌های حاوی محیط کشت نوترینت آگار بوسیله‌ی سواپ استریل به صورت یکنواخت کشت داده شدند، سپس دیسک‌های خالی (Blank disk) 6 میلی متری در شرایط کاملاً استریل به 50 میکرولیتر از عصاره آغشته و به منظور خشک شدن به مدت 30 دقیقه در گرمخانه در دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شدو سپس دیسک‌ها در داخل پلیت‌ها به فاصله مناسب قرار گرفته و پس از گرمخانه گذاری به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس، قطر هاله‌ی عدم رشد بوسیله خط کش برای هر کدام از آنها اندازه‌گیری و بر حسب میلیمتر گزارش گردید. تمامی این عملیات برای سویه‌های باکتریایی مورد مطالعه به صورت جداگانه انجام گردید.
برای همه نمونه‌های مورد آزمایش یک نمونه به عنوان نمونه شاهد استفاده گردید (حاوی محیط کشت نوترینت براث و باکتری‌ها، بدون عصاره پوست انار). تمامی آزمایشات حذف باکتری‌ها در محیط آبی با خصوصیات PBS انجام گردید (جدول1).
جدول 1. خصوصیات بافر فسفات نرمال سالین
| PBS, 0.01 M | |
| 8 گرم | NaCl |
| 2/0 گرم | KCl |
| 17/2 گرم | Na2HPO4 7H2O |
| 259/0 گرم | KH2PO4 |
| 1 لیتر | آب مقطر |
مقایسه خواص ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل
به منظور مقایسه عصاره پوست انار با فنل طبق روش MIC و MBC، رقت‌های یک دوم، یک چهارم، یک هشتم، یک شانزدهم، یک سی و دوم، یک شصت و چهارم، یک صد و بیست و هشتم، یک دویست و پنجاه و ششم عصاره پوست انار تهیه و همچنین فنل مادر که از شرکت مرک خریداری شده بود با غلظت‌های مختلف (5000، 2500، 1250 و 675 میلی‌گرم در لیتر) در لوله‌های آزمایش تهیه گردید. فنل مادر از شرکت مرک خریداری شد. به هر کدام از چاهک‌ها تعداد معینی از باکتری‌های (CFU/ml 104×5/7) مورد آزمایش اضافه شد. سپس در زمان‌های 5، 10 و 15 دقیقه نمونه‌ای به اندازه 10 میکرولیتر از هر یک چاهک برداشته شد و در محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شد. و سپس در دستگاه انکوباتور به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس قرار داده شد. پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سانتیگرداد نمونه‌ها از نظر رشد تعداد باکتری‌ها مورد مقایسه قرار گرفتند.
یافته‌ها
تعیین حداقل غلظت بازدارندگی ((MIC و حداقل غلظت کشندگی (MBC)
مقدار MIC و MBC عصاره پوست انار برای باکتری‌های شیگلا دیسانتری و اشرشیاکلی به ترتیب در رقت‌های 5/12% و 25%، کلبسیلا پنومونیه در رقت 25% و آنتروباکتر آئروژنز به ترتیب در رقت‌های 25/6% و 25% بدست آورده شد. در جدول 2 اثرات ضدباکتریایی رقت‌های مختلف عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های مورد نظر نشان داده شده است.
جدول 2. تأثیر رقت‌های مختلف عصاره پوست انار بر رشد باکتری
| رقت عصاره پوست انار | تأثیر بر رشد باکتری‌ها | |||
| شیگلا دیسانتری | اشرشیاکلی | کلبسیلا پنومونیه | انتروباکتر آئروژنز | |
| 50 % | باکتری کشی | باکتری کشی | باکتری کشی | باکتری کشی |
| 25 % | MBC | MBC | MIC و MBC | MBC |
| 5/12 % | MIC | MIC | رشد | بازدارندگی |
| 25/6 % | رشد | رشد | رشد | MIC |
| 125/3 % | رشد | رشد | رشد | رشد |
| شاهد (کنترل منفی) | عدم رشد | عدم رشد | عدم رشد | عدم رشد |
| شاهد (کنترل مثبت) | رشد | رشد | رشد | رشد |
تعیین قطر هاله عدم رشد (ZOI)
قطر هاله عدم رشد برای باکتری‌های شیگلا دیسانتری، اشرشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه و آنتروباکتر آئروژنز به ترتیب 18، 19، 16 و 22 میلیمتر بدست آمد (شکل3).
نتایج مقایسه خواص ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل
در مقایسه‌ی اثر ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل مشاهده شد که عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های اشرشیاکلی در زمان‌های 5 و 10 دقیقه تماس، در رقت 25/6% و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشته (تعداد کلنی‌ها غیر قابل شمارش بود) و فقط در 15 دقیقه تماس در رقت 5000 میلی گرم بر لیتر باعث کاهش تعداد کلنی باکتری به 68 کلنی شده بود. در مورد باکتری‌های شیگلا دیسانتری در زمان‌های 5 و 10 و 15 دقیقه تماس، عصاره پوست انار در رقت 25/6% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه در زمان‌های 5 و 10 دقیقه تماس در رقت 5/12% و در 15 دقیقه تماس در رقت 25% اثر کشندگی از خود نشان داد در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز در زمان 5 دقیقه تماس در رقت 25/6% و در زمان‌های 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت (شکل 4).
قطر هاله عدم رشد برای باکتری‌های شیگلا دیسانتری، اشرشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه و آنتروباکتر آئروژنز به ترتیب 18، 19، 16 و 22 میلیمتر بدست آمد (شکل3).
نتایج مقایسه خواص ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل
در مقایسه‌ی اثر ضد باکتریایی عصاره پوست انار با فنل مشاهده شد که عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های اشرشیاکلی در زمان‌های 5 و 10 دقیقه تماس، در رقت 25/6% و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشته (تعداد کلنی‌ها غیر قابل شمارش بود) و فقط در 15 دقیقه تماس در رقت 5000 میلی گرم بر لیتر باعث کاهش تعداد کلنی باکتری به 68 کلنی شده بود. در مورد باکتری‌های شیگلا دیسانتری در زمان‌های 5 و 10 و 15 دقیقه تماس، عصاره پوست انار در رقت 25/6% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه در زمان‌های 5 و 10 دقیقه تماس در رقت 5/12% و در 15 دقیقه تماس در رقت 25% اثر کشندگی از خود نشان داد در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز در زمان 5 دقیقه تماس در رقت 25/6% و در زمان‌های 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت در حالی که فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت (شکل 4).
شکل 3. قطر هاله عدم رشد باکتری‌های شیگلا دیسانتری، کلبسیلا پنومونیه و انتروباکتر آئروژنز (الف) و اشرشیا کلی (ب)
شکل 4. نمونه‌ای از تصاویر مربوط به مقایسه خاصیت ضدباکتریایی عصاره پوست انار با فنل
بحث
در مطالعه حاضر با افزایش غلظت عصاره پوست انار میزان رشد باکتری‌ها کاهش یافت. نتایج حاصل از MIC و MBC نشان می‌دهد که حساس‌ترین باکتری به عصاره پوست انار در بین باکتری‌های مورد مطالعه انتروباکتر آئروژنز و مقاوم‌ترین آن کلبسیلا پنومونیه می‌باشد. به طوری که عصاره پوست انار در رقت 25/6% بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز اثر بازدارندگی و در رقت %25 اثر کشندگی داشت در حالی که عصاره در رقت 25% بر روی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه اثر بازدارندگی و کشندگی داشت. همچنین میزان حساسیت باکتری‌های اشرشیاکلی با شیگلا دیسانتری تقریباً برابر بدست آمد. بطوری که حداقل غلظت بازدارندگی عصاره پوست انار بر روی هر دو باکتری در رقت 5/12% و حداقل غلظت کشندگی آن در رقت 25% بدست آمد. تفاوت بین حساسیت و مقاومت باکتری‌های متعلق به یک خانواده ممکن است به دلیل تفاوت در ساختارهای موجود در غشاء و یا آنزیم‌های تولیدی توسط باکتری بر علیه آنتی‌بیوتیک مورد استفاده باشد. نتایج به دست آمده از آزمایش هاله عدم رشد هم با نتایج MIC و MBC مطابقت دارد. در این آزمایش هم باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز حساس‌ترین وکلبسیلا پنومونیه مقاوم‌ترین باکتری در بین باکتری‌های مورد بررسی بدست آمد. بطوری که قطر هاله عدم رشد برای باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز 13 میلیمتر و برای باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه 13 میلی متر بدست آمد. اندازه قطر هاله عدم رشد باکتری‌های اشرشیاکلی (14 میلیمتر) و شیگلا دیسانتری (15 میلیمتر) مطابق با نتایج MIC و MBC نشان می‌دهد اشرشیا کلی و شیگلا دیسانتری از لحاظ حساسیت و مقاومت به عصاره تقریباً برابر هستند. در صورتی که نتایج MIC و MBC با نتایج قطر هاله عدم رشد برابر نبود. به دلیل کمی بودن روش MIC و MBC استناد به نتایج این آزمایشات نسبت به روش قطر هاله عدم رشد که روشی کیفی کیفی محسوب می‌شود، پیشنهاد می‌شود. حسین عبدو و همکارانش در سال 2020 پژوهشی تحت عنوان تجزیه و تحلیل پلی فنل‌ها، فلاونوئیدها و فعالیت ضد میکروبی در عصاره پوست انار انجام دادند. فعالیت ضد میکروبی چهار غلظت مختلف آماده شده از چهار عصاره پوست انار بر روی دو باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژنوزا، باکتری گرم منفی اسینتوباکتر بومانی و قارچ کاندیدا پاراپسیلوزیس بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره استونی به ترتیب دارای بیشترین مقدار پلی‌فنل کل و محتوای فلاونوئید کل در مقایسه با متانول بوده و فعالیت ضد میکروبی عصاره استونی بر روی همه میکروارگانیسم‌ها بالاترین مقدار و پس از آن عصاره متانول و اتانول است (25). همچنین در مطالعه‌ای دیگر رهنمون و همکارانش در سال 2016 تأثیر شرایط استخراج بر میزان ترکیبات فنلی و خاصیت ضدمیکروبی عصاره پوست انار را بررسی کردند. در این پژوهش قدرت ضدمیکروبی عصاره‌های استخراج شده علیه چند میکروارگانیسم شاخص در مواد غذایی شامل سالمونلا اینتریتیدیس، اشریشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوکوس اورئوس، آسپرژیلوس نایجر و ساکارومایسس سرویزیه با روش انتشار دیسک تعیین شد. نتایج نشان داد عصاره استخراج شده در نسبت 60 به 40 اتانول به آب، دمای 25 درجه سانتیگراد و زمان 24 ساعت، بیشترین بازدهی استخراج و نیز قویترین خاصیت ضدمیکروبی به دست آمد (26). مقایسه خاصیت ضد باکتریایی مواد با فنل به عنوان شاخصی برای تعیین میزان اثر ضدباکتریایی آن معرفی شده است، که در مورد عصاره گیاهان ضروری است به این موضوع توجه و اهمیت داده شود. به همین دلیل در این مطالعه شاخص مذکور نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. در این آزمایش مقاوم‌ترین باکتری همانند نتایج آزمایشات قبلی کلبسیلا پنومونیه و حساست ترین باکتری بر خلاف آزمایشات قبل، شیگلا دیسانتری بدست آمد. بطوری که عصاره پوست انار در مقایسه با فنل بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز در زمان 5 دقیقه تماس در رقت 25/6% و در زمان‌های 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت اما فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری در زمان‌های 5 و 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 25/6% اثر کشندگی داشت اما فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. علت متفاوت بودن مقاوم‌ترین و حساس‌ترین باکتری در بین باکتری‌های مورد مطالعه در روش مقایسه اثر ضدباکتریایی عصاره پوست انار با فنل با نتایج حاصل از آزمایشات MIC، MBC و قطر هاله عدم رشد به کاهش زمان مواجهه باکتری با عصاره مربوط می‌شود.
عصاره پوست انار اثرات ضد باکتریایی خود را از طریق تغییر ساختار و عملکرد غشای باکتری با افزایش نفوذ پذیری آن اعمال می‌کند که باعث متورم شدن غشاء شده و در نهایت باعث مرگ باکتری می‌شود. اثرات ضدباکتریایی این عصاره معمولاً به دلیل وجود مقادیر زیاد الاژیک اسید و پونیکالاژین در عصاره می‌باشد که علاوه بر باکتری‌های گرم منفی بر روی باکتری‌های گرم مثبت نیز اثر ضد باکتریایی دارد. اما میزان تأثیر بر روی باکتری‌های گرم مثبت نسبت به باکتری‌های گرم منفی کمتر است (27). این به دلیل وجود لایه ضخیم پپتیدوگلیکان در باکتری‌های گرم مثبت می‌باشد، که منجر می‌شود آنتی‌بیوتیک‌ها نفوذپذیری کمتری از غشا باکتری به داخل سلول و در نهایت مرگ سلولی داشته باشد. حبیب پور و همکارانش در سال 2015 در مطالعه‌ای اثر غلظت‌های مختلف عصاره پوست انار بر روی تشکیل بیوفیلم باکتری سودوموناس آئروژینوزا را بررسی کردند. در این مطالعه تجربی میزان اثر ضد بیوفیلمی، میزان درصد کاهش تشکیل بیوفیلم و سنتیک رشد باکتری سودوموناس آئروژینوزا در تیمارهای مختلف به روش رقیق سازی میکرو و رنگ سنجی با کریستال ویوله اندازه‌گیری شد. یافته‌ها نشان داد که در تمامی تیمارها در شش ساعت اول باکتری قادر به تولید بیوفیلم نبوده و در تیمار 12 ساعته با غلظت‌های 01/0 و 05/0 میلی‌گرم در لیتر و در تیمارهای 18 و 24 ساعته با غلظت 001/0 میلی‌گرم در لیتر عـصاره پوست انار به ترتیب تأثیر بازدارندگی تشکیل بیوفیلم متوسط و قوی مشاهده شد (28). همچنین الزورکی و همکارانش در سال 2009 در مطالعه‌ای فعالیت ضد میکروبی پوست انار را بررسی کردند. فعالیت ضد میکروبی در برابر برخی از پاتوژن‌های منتقله از غذا توسط عصاره پوست میوه انار با استفاده از روش آزمایشگاهی دیسک انتشاری ارزیابی شد. عصاره متانولی 80 درصد استخراج شده از پوست انار یک بازدارنده قوی در برابر لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکلی و یرسینیا انتروکولیتیکا بود. حداقل غلظت مهارکنندگی این عصاره در برابر سالمونلا انتریتدیس 4 میلی‌گرم بر لیتر بود. مطالعه حاظر با تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی خصوصیات ضدباکتریایی عصاره پوست انار مطابقت دارد.
از نتایج مطالعه حاضر می‌توان پـی بـرد کـه کـارایی غلطت های مختلف عصاره پوست انار در مهار رشد و کشتن باکتری‌های گرم منفی مورد مطالعه متفـاوت می‌باشد. همچنین در زمان تماس کوتاه‌تر نسبت به فنل باعث حذف این باکتری‌ها می‌شود. اما اثبات فعالیت ضد باکتریایی عصاره پوست انار بر روی این پاتوژن‌های بیماری‌زا این امیدواری را ایجاد نمود تا بتوان این ماده یا ترکیبات آن را به عنوان یک داروی ضد باکتریایی مناسب مدنظر قرار داده و با انجام تحقیقات بیشتر به عنوان جایگزینی برای داروهای ضدباکتریایی دارای مورد استفاده قرار داد. انجام تحقیقات بیشتر روی طیف وسیع‌تری از باکتری‌های گرم منفی پاتوژن و متعاقب آن تحقیق در نمونه‌های بالینی و بیماران مبتلا به عفونت‌های باکتریایی، از جمله موارد اصلی برای نیل به این هدف خواهد بود. بنابراین در مطالعات بعدی پیشنهاد می‌شود اثرات این مواد را بر روی طیف وسیع‌تری از باکتری‌ها انجام داده و در صورت امکان، ارزیابی اقتصادی برای سنتز و کاربرد گستره آن صورت گیرد.
سپاسگزاری
بدینوسیله از ریاست محترم، معاونت و کمیته تحقیقات و فناوری دانشجویی دانشکده علوم پزشکی و خدمات بهداشتی و درمانی خلخال بخاطر حمایت‌های مالی و معنوی صمیمانه تقدیر و تشکر می‌نماییم. این طرح تحقیقاتی دارای کد اخلاق در پژوهش به شماره IR.KHALUMS.REC.1402.006 و کد طرح پژوهشی به شماره IR-KHS-1402-02- 59 می‌باشد.
در مطالعه حاضر با افزایش غلظت عصاره پوست انار میزان رشد باکتری‌ها کاهش یافت. نتایج حاصل از MIC و MBC نشان می‌دهد که حساس‌ترین باکتری به عصاره پوست انار در بین باکتری‌های مورد مطالعه انتروباکتر آئروژنز و مقاوم‌ترین آن کلبسیلا پنومونیه می‌باشد. به طوری که عصاره پوست انار در رقت 25/6% بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز اثر بازدارندگی و در رقت %25 اثر کشندگی داشت در حالی که عصاره در رقت 25% بر روی باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه اثر بازدارندگی و کشندگی داشت. همچنین میزان حساسیت باکتری‌های اشرشیاکلی با شیگلا دیسانتری تقریباً برابر بدست آمد. بطوری که حداقل غلظت بازدارندگی عصاره پوست انار بر روی هر دو باکتری در رقت 5/12% و حداقل غلظت کشندگی آن در رقت 25% بدست آمد. تفاوت بین حساسیت و مقاومت باکتری‌های متعلق به یک خانواده ممکن است به دلیل تفاوت در ساختارهای موجود در غشاء و یا آنزیم‌های تولیدی توسط باکتری بر علیه آنتی‌بیوتیک مورد استفاده باشد. نتایج به دست آمده از آزمایش هاله عدم رشد هم با نتایج MIC و MBC مطابقت دارد. در این آزمایش هم باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز حساس‌ترین وکلبسیلا پنومونیه مقاوم‌ترین باکتری در بین باکتری‌های مورد بررسی بدست آمد. بطوری که قطر هاله عدم رشد برای باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز 13 میلیمتر و برای باکتری‌های کلبسیلا پنومونیه 13 میلی متر بدست آمد. اندازه قطر هاله عدم رشد باکتری‌های اشرشیاکلی (14 میلیمتر) و شیگلا دیسانتری (15 میلیمتر) مطابق با نتایج MIC و MBC نشان می‌دهد اشرشیا کلی و شیگلا دیسانتری از لحاظ حساسیت و مقاومت به عصاره تقریباً برابر هستند. در صورتی که نتایج MIC و MBC با نتایج قطر هاله عدم رشد برابر نبود. به دلیل کمی بودن روش MIC و MBC استناد به نتایج این آزمایشات نسبت به روش قطر هاله عدم رشد که روشی کیفی کیفی محسوب می‌شود، پیشنهاد می‌شود. حسین عبدو و همکارانش در سال 2020 پژوهشی تحت عنوان تجزیه و تحلیل پلی فنل‌ها، فلاونوئیدها و فعالیت ضد میکروبی در عصاره پوست انار انجام دادند. فعالیت ضد میکروبی چهار غلظت مختلف آماده شده از چهار عصاره پوست انار بر روی دو باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژنوزا، باکتری گرم منفی اسینتوباکتر بومانی و قارچ کاندیدا پاراپسیلوزیس بررسی شد. نتایج نشان داد که عصاره استونی به ترتیب دارای بیشترین مقدار پلی‌فنل کل و محتوای فلاونوئید کل در مقایسه با متانول بوده و فعالیت ضد میکروبی عصاره استونی بر روی همه میکروارگانیسم‌ها بالاترین مقدار و پس از آن عصاره متانول و اتانول است (25). همچنین در مطالعه‌ای دیگر رهنمون و همکارانش در سال 2016 تأثیر شرایط استخراج بر میزان ترکیبات فنلی و خاصیت ضدمیکروبی عصاره پوست انار را بررسی کردند. در این پژوهش قدرت ضدمیکروبی عصاره‌های استخراج شده علیه چند میکروارگانیسم شاخص در مواد غذایی شامل سالمونلا اینتریتیدیس، اشریشیاکلی، لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوکوس اورئوس، آسپرژیلوس نایجر و ساکارومایسس سرویزیه با روش انتشار دیسک تعیین شد. نتایج نشان داد عصاره استخراج شده در نسبت 60 به 40 اتانول به آب، دمای 25 درجه سانتیگراد و زمان 24 ساعت، بیشترین بازدهی استخراج و نیز قویترین خاصیت ضدمیکروبی به دست آمد (26). مقایسه خاصیت ضد باکتریایی مواد با فنل به عنوان شاخصی برای تعیین میزان اثر ضدباکتریایی آن معرفی شده است، که در مورد عصاره گیاهان ضروری است به این موضوع توجه و اهمیت داده شود. به همین دلیل در این مطالعه شاخص مذکور نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. در این آزمایش مقاوم‌ترین باکتری همانند نتایج آزمایشات قبلی کلبسیلا پنومونیه و حساست ترین باکتری بر خلاف آزمایشات قبل، شیگلا دیسانتری بدست آمد. بطوری که عصاره پوست انار در مقایسه با فنل بر روی باکتری‌های انتروباکتر آئروژنز در زمان 5 دقیقه تماس در رقت 25/6% و در زمان‌های 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 5/12% اثر کشندگی داشت اما فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. همچنین عصاره پوست انار بر روی باکتری‌های شیگلا دیسانتری در زمان‌های 5 و 10 و 15 دقیقه تماس در رقت 25/6% اثر کشندگی داشت اما فنل در این بازه‌های زمانی اثر کشندگی نداشت. علت متفاوت بودن مقاوم‌ترین و حساس‌ترین باکتری در بین باکتری‌های مورد مطالعه در روش مقایسه اثر ضدباکتریایی عصاره پوست انار با فنل با نتایج حاصل از آزمایشات MIC، MBC و قطر هاله عدم رشد به کاهش زمان مواجهه باکتری با عصاره مربوط می‌شود.
عصاره پوست انار اثرات ضد باکتریایی خود را از طریق تغییر ساختار و عملکرد غشای باکتری با افزایش نفوذ پذیری آن اعمال می‌کند که باعث متورم شدن غشاء شده و در نهایت باعث مرگ باکتری می‌شود. اثرات ضدباکتریایی این عصاره معمولاً به دلیل وجود مقادیر زیاد الاژیک اسید و پونیکالاژین در عصاره می‌باشد که علاوه بر باکتری‌های گرم منفی بر روی باکتری‌های گرم مثبت نیز اثر ضد باکتریایی دارد. اما میزان تأثیر بر روی باکتری‌های گرم مثبت نسبت به باکتری‌های گرم منفی کمتر است (27). این به دلیل وجود لایه ضخیم پپتیدوگلیکان در باکتری‌های گرم مثبت می‌باشد، که منجر می‌شود آنتی‌بیوتیک‌ها نفوذپذیری کمتری از غشا باکتری به داخل سلول و در نهایت مرگ سلولی داشته باشد. حبیب پور و همکارانش در سال 2015 در مطالعه‌ای اثر غلظت‌های مختلف عصاره پوست انار بر روی تشکیل بیوفیلم باکتری سودوموناس آئروژینوزا را بررسی کردند. در این مطالعه تجربی میزان اثر ضد بیوفیلمی، میزان درصد کاهش تشکیل بیوفیلم و سنتیک رشد باکتری سودوموناس آئروژینوزا در تیمارهای مختلف به روش رقیق سازی میکرو و رنگ سنجی با کریستال ویوله اندازه‌گیری شد. یافته‌ها نشان داد که در تمامی تیمارها در شش ساعت اول باکتری قادر به تولید بیوفیلم نبوده و در تیمار 12 ساعته با غلظت‌های 01/0 و 05/0 میلی‌گرم در لیتر و در تیمارهای 18 و 24 ساعته با غلظت 001/0 میلی‌گرم در لیتر عـصاره پوست انار به ترتیب تأثیر بازدارندگی تشکیل بیوفیلم متوسط و قوی مشاهده شد (28). همچنین الزورکی و همکارانش در سال 2009 در مطالعه‌ای فعالیت ضد میکروبی پوست انار را بررسی کردند. فعالیت ضد میکروبی در برابر برخی از پاتوژن‌های منتقله از غذا توسط عصاره پوست میوه انار با استفاده از روش آزمایشگاهی دیسک انتشاری ارزیابی شد. عصاره متانولی 80 درصد استخراج شده از پوست انار یک بازدارنده قوی در برابر لیستریا مونوسیتوژنز، استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکلی و یرسینیا انتروکولیتیکا بود. حداقل غلظت مهارکنندگی این عصاره در برابر سالمونلا انتریتدیس 4 میلی‌گرم بر لیتر بود. مطالعه حاظر با تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی خصوصیات ضدباکتریایی عصاره پوست انار مطابقت دارد.
از نتایج مطالعه حاضر می‌توان پـی بـرد کـه کـارایی غلطت های مختلف عصاره پوست انار در مهار رشد و کشتن باکتری‌های گرم منفی مورد مطالعه متفـاوت می‌باشد. همچنین در زمان تماس کوتاه‌تر نسبت به فنل باعث حذف این باکتری‌ها می‌شود. اما اثبات فعالیت ضد باکتریایی عصاره پوست انار بر روی این پاتوژن‌های بیماری‌زا این امیدواری را ایجاد نمود تا بتوان این ماده یا ترکیبات آن را به عنوان یک داروی ضد باکتریایی مناسب مدنظر قرار داده و با انجام تحقیقات بیشتر به عنوان جایگزینی برای داروهای ضدباکتریایی دارای مورد استفاده قرار داد. انجام تحقیقات بیشتر روی طیف وسیع‌تری از باکتری‌های گرم منفی پاتوژن و متعاقب آن تحقیق در نمونه‌های بالینی و بیماران مبتلا به عفونت‌های باکتریایی، از جمله موارد اصلی برای نیل به این هدف خواهد بود. بنابراین در مطالعات بعدی پیشنهاد می‌شود اثرات این مواد را بر روی طیف وسیع‌تری از باکتری‌ها انجام داده و در صورت امکان، ارزیابی اقتصادی برای سنتز و کاربرد گستره آن صورت گیرد.
سپاسگزاری
بدینوسیله از ریاست محترم، معاونت و کمیته تحقیقات و فناوری دانشجویی دانشکده علوم پزشکی و خدمات بهداشتی و درمانی خلخال بخاطر حمایت‌های مالی و معنوی صمیمانه تقدیر و تشکر می‌نماییم. این طرح تحقیقاتی دارای کد اخلاق در پژوهش به شماره IR.KHALUMS.REC.1402.006 و کد طرح پژوهشی به شماره IR-KHS-1402-02- 59 می‌باشد.
نوع مطالعه: پژوهشي |
موضوع مقاله:
گیاهان دارویی
فهرست منابع
1. Jahani S, Saeidi S, Javadian F, Akbarizadeh Z, Sobhanizade A. Investigating the antibacterial effects of plant extracts on Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Int J Infect. 2016;3(2). [DOI:10.17795/iji-34081]
2. Van Wyk BE, Wink M. Medicinal plants of the world: Cabi;2018. [DOI:10.1079/9781786393258.0000]
3. Huh AJ, Kwon YJ. "Nanoantibiotics": a new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2011;156(2):128-45. [DOI:10.1016/j.jconrel.2011.07.002] [PMID]
4. Petrovska BB. Historical review of medicinal plants' usage. Pharmacognosy reviews. 2012;6(11):1-5. [DOI:10.4103/0973-7847.95849] [PMID] []
5. Eghbal GM, Borji A, Naghavi A, Zangiabadi M, Bokaeian M. Antimicrobial resistance of shigella species isolated from diarrheal patients in zahedan. 2009.
6. Drummond RA, Desai JV, Ricotta EE, Swamydas M, Deming C, Conlan S, et al. Long-term antibiotic exposure promotes mortality after systemic fungal infection by driving lymphocyte dysfunction and systemic escape of commensal bacteria. Cell host & microbe. 2022;30(7):1020-33 e6. [DOI:10.1016/j.chom.2022.04.013] [PMID] []
7. Bornet C, Davin-Regli A, Bosi C, Pages JM, Bollet C. Imipenem resistance of enterobacter aerogenes mediated by outer membrane permeability. Journal of clinical microbiology. 2000;38(3):1048-52. [DOI:10.1128/JCM.38.3.1048-1052.2000] [PMID] []
8. Malviya S, Arvind, Jha A, Hettiarachchy N. Antioxidant and antibacterial potential of pomegranate peel extracts. Journal of food science and technology. 2014;51(12):4132-7. [DOI:10.1007/s13197-013-0956-4] [PMID] []
9. Mirjalili A. A review on biochemical constituents and medicinal properties of pomegranate (Punica granatum L.). J Med Plant. 2015;14(56):1-22.
10. Mphahlele RR, Fawole OA, Makunga NP, Opara UL. Effect of drying on the bioactive compounds, antioxidant, antibacterial and antityrosinase activities of pomegranate peel. BMC complementary and alternative medicine. 2016;16:143. [DOI:10.1186/s12906-016-1132-y] [PMID] []
11. Salahvarzi Y, Tehranifar A, Jahanbakhsh V. Relation of antioxidant and antifungal activity of different parts of pomegranate (Punica granatum L.) extracts with its phenolic content. Iran J Med Aromatic Plant. 2011;27(1).
12. Masjedian F, Valehi F, Talebi A, Rastegar Lari A. Evaluation of wide broad spectrum antibiotic resistance of E. coliand Klebsiella pneumonia. Iran J Med Microbiol. 2007;1(2):27-34.
13. Ibrahim M, Bahout A, Ayoub M, El-Said EI, Abd ElAal SF. Chemical and Microbiological Evaluation of Raw Buffalo Milk Locally Produced in Sharkia Governorate. Zagazig Veterinar J. 2019;47(4):352-63. [DOI:10.21608/zvjz.2019.14075.1051]
14. Yang J, Ye L, Wang W, Luo Y, Zhang Y, Han L. Diverse prevalence of 16S rRNA methylase genes armA and rmtB amongst clinical multidrug-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates. International journal of antimicrobial agents. 2011;38(4):348-51. [DOI:10.1016/j.ijantimicag.2011.04.021] [PMID]
15. Navidinia M, Karimi A, Rahbar M, Fallah F, Ahsani RR, Malekan MA, et al. Study Prevalence of Verotoxigenic E.coli Isolated from Urinary Tract Infections (UTIs) in an Iranian Children Hospital. The open microbiology journal. 2012;6:1-4. [DOI:10.2174/1874285801206010001] [PMID] []
16. Roy S, Viswanathan R, Singh AK, Das P, Basu S. Sepsis in neonates due to imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 in India. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 2011;66(6):1411-3. [DOI:10.1093/jac/dkr068] [PMID]
17. Padilla E, Llobet E, Domenech-Sanchez A, Martinez-Martinez L, Bengoechea JA, Alberti S. Klebsiella pneumoniae AcrAB efflux pump contributes to antimicrobial resistance and virulence. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2010;54(1):177-83. [DOI:10.1128/AAC.00715-09] [PMID] []
18. Ferreccio C, Prado V, Ojeda A, Cayyazo M, Abrego P, Guers L, et al. Epidemiologic patterns of acute diarrhea and endemic Shigella infections in children in a poor periurban setting in Santiago, Chile. American journal of epidemiology. 1991;134(6):614-27. [DOI:10.1093/oxfordjournals.aje.a116134] [PMID]
19. Kosek M, Yori PP, Pan WK, Olortegui MP, Gilman RH, Perez J, et al. Epidemiology of highly endemic multiply antibiotic-resistant shigellosis in children in the Peruvian Amazon. Pediatrics. 2008;122(3):e541-9. [DOI:10.1542/peds.2008-0458] [PMID] []
20. Davin-Regli A, Pages JM. Enterobacter aerogenes and Enterobacter cloacae; versatile bacterial pathogens confronting antibiotic treatment. Frontiers in microbiology. 2015;6:392. [DOI:10.3389/fmicb.2015.00392] [PMID] []
21. Zhang C, Lv FX, Xing XH. Bioengineering of the Enterobacter aerogenes strain for biohydrogen production. Bioresource technology. 2011;102(18):8344-9. [DOI:10.1016/j.biortech.2011.06.018] [PMID]
22. Abbasi E, Javaheri J, Momeni H, Ghaznavi-Rad E. High Prevalence of Extended Spectrum Beta-Lactamase Resistance of Shigella Species in Diarrhea Samples in Khomein, Iran. J Arak Univ Med Sci. 2019;22(2):75-83.
23. Rastegar A, Nazari S, Allahabadi A, Falanji F, Akbari Dourbash FAD, Rezai Z, et al. Antibacterial activity of amino- and amido- terminated poly (amidoamine)-G6 dendrimer on isolated bacteria from clinical specimens and standard strains. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 2017;31:64. [DOI:10.14196/mjiri.31.64] [PMID] []
24. Humphries RM, Ambler J, Mitchell SL, Castanheira M, Dingle T, Hindler JA, et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group Best Practices for Evaluation of Antimicrobial Susceptibility Tests. Journal of clinical microbiology. 2018;56(4). [DOI:10.1128/JCM.01934-17] [PMID] []
25. Abdu OH, Saeed AA, Fdhel TA. Polyphenols/flavonoids analysis and antimicrobial activity in pomegranate peel extracts. Elect J Univ Aden Basic Appl Sci. 2020;1(1):14-9. [DOI:10.47372/ejua-ba.2020.1.4]
26. Rahnemoon P, Sarabi JM, Javanmard DM, Bostan A. Evaluation of extraction conditions on phenolic compounds and antimicrobial properties of pomegranate (Punica granatum) peels.2017.
27. Verma RS, Joshi N, Padalia RC, Goswami P, Singh VR, Chauhan A. Chemical composition and allelopathic, antibacterial, antifungal and in vitro acetylcholinesterase inhibitory activities of yarrow (Achillea millefolium L.) native to India. Indust Crop Product. 2017;104:144-55. [DOI:10.1016/j.indcrop.2017.04.046]
28. Habibipour R, Moradi Haghgou L. Study on hydro-alcoholic extract effect of pomegranate peel on pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Avicenna J Clinic Med. 2015;22(3):195-202.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
تماس با ما
مجله طب مکمل
اراک، سردشت، میدان بسیج، مجتمع دانشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اراک، بال آبی، دفتر مجله طب مکمل
تلفن دفتر نشریه: 08634173524
ایمیل: journalcmjaarakmu.ac.ir
